DNA甲基化組+轉(zhuǎn)錄組+宏基因組+16S多組學(xué)關(guān)聯(lián)研究思路介紹
本期我們以一篇多組學(xué)研究揭示DNA甲基化在植物促生菌-植物-微生物互作關(guān)系中作用的文獻(xiàn)案例來(lái)講解多組學(xué)研究如何做，并對(duì)多組學(xué)研究分析方法和組學(xué)分子實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證思路進(jìn)行總結(jié)，一起來(lái)看看吧。
2022年02月24日，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)沈振國(guó)和蔣建東教授團(tuán)隊(duì)合作在期刊《Microbiome》（IF:14.65/1區(qū)）發(fā)表了題為“Long-term effect of epigenetic modification in plant–microbe interactions: modification of DNA methylation induced by plant growth-promoting bacteria mediates promotion process”的最新研究成果。該研究通過(guò)多組學(xué)分析探討了植物、土壤微生物組、植物促生菌之間的復(fù)雜互作關(guān)系，發(fā)現(xiàn)植物促生菌（plant growth-promoting bacteria,PGPB）通過(guò)調(diào)控植物根際DNA甲基化而長(zhǎng)效促進(jìn)植物生長(zhǎng)的新機(jī)制，首次提出PGPB-植物-微生物組互作的二階段模型，為PGPB影響根際微生物組提供新的思路。
標(biāo)題：表觀(guān)遺傳修飾對(duì)植物-微生物互作的長(zhǎng)效影響：PGPB誘導(dǎo)的DNA甲基化修飾介導(dǎo)促進(jìn)過(guò)程
時(shí)間：2022-02-24
期刊：Microbiome
影響因子：IF 14.65/1區(qū)
技術(shù)平臺(tái)： 16S rRNA 擴(kuò)增子測(cè)序、宏基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序、WGBS、RNA-seq、qRT-PCR（易基因均可提供）
背景：
土壤微生物群被認(rèn)為是下一次綠色革命的基石，而PGPB是微生物組工程的關(guān)鍵。然而，將植物有益微生物從發(fā)現(xiàn)到農(nóng)業(yè)應(yīng)用仍然具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)橛幸婢昱c原生土壤中的植物間的互作機(jī)制在很大程度上還未知。越來(lái)越多的研究表明，微生物組引入的菌株通常會(huì)在土壤中被消除；而其他一些研究報(bào)告指出，使用PGPB作為接種物可以顯著促進(jìn)植物生長(zhǎng)。這種矛盾表明需要更深入了解微生物誘導(dǎo)的生長(zhǎng)促進(jìn)機(jī)制。
材料方法
土壤：從表層土壤（0-15 cm深度）采集，去除植物碎片和石頭，在實(shí)驗(yàn)室4°C儲(chǔ)存直至使用。
菌株：芽孢桿菌屬PGP5和節(jié)桿菌屬PGP41（Bacillus sp. PGP5 and Arthrobacter sp. PGP41）。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
將對(duì)照組（Ste）和經(jīng)DNA甲基化抑制劑Zebularine（Zeb）處理的美洲陸商（Phytolacca americana）植物種至PGP5（接種菌株P(guān)GP5）、PGP41（接種菌株P(guān)GP41）和CK（滅菌）土壤中。所有處理一式三份進(jìn)行。在接種后0,3,7,15,21,30天對(duì)植物和根際土壤進(jìn)行取樣。將樣品在液氮中冷凍，保存在–80°C直至分析。
采用多組學(xué)方法對(duì)根際復(fù)雜互作關(guān)系進(jìn)行綜合研究。分別通過(guò)擴(kuò)增子和宏基因組測(cè)序分析根際微生物組在分類(lèi)學(xué)和功能水平上的變化。分別通過(guò)轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化測(cè)序分析根際根系在轉(zhuǎn)錄和表觀(guān)遺傳學(xué)水平上的變化。
結(jié)果：
研究人員展示了在去除土壤中的PGPB接種物后，PGPB誘導(dǎo)的長(zhǎng)期植物促生作用，并探討了外源接種物、內(nèi)源微生物組和植物之間的三種相互作用，這是植物促生過(guò)程的關(guān)鍵要素。研究發(fā)現(xiàn)根際微生物組的組成主要受植物發(fā)育驅(qū)動(dòng)，根系募集大大減弱了接種物對(duì)根際微生物組的影響。根際微生物組變化和根系接種物定殖都不是促進(jìn)植物生長(zhǎng)的必要條件。在根系接種后引起的DNA甲基化修飾會(huì)影響與PGPB誘導(dǎo)的促生相關(guān)基因表達(dá)，并且接種誘導(dǎo)的DNA甲基化模式變化大大削弱了植物促生作用。總之，結(jié)果表明PGPB誘導(dǎo)的根系DNA甲基化修飾介導(dǎo)了促生過(guò)程，并且這些修飾在從微生物組中去除接種物后仍具有此功能。
關(guān)鍵圖形：
（1）16S多樣性分析表明根際微生物組組成主要由植物發(fā)育驅(qū)動(dòng)
研究發(fā)現(xiàn)，根際微生物組的組成主要由植物的發(fā)育驅(qū)動(dòng)，表明根際分隔可能對(duì)根際微生物組具有募集效應(yīng)，其在根系與特定細(xì)菌之間形成密切關(guān)系后穩(wěn)定了根際微生物組。
圖1：根系誘導(dǎo)的根際微生物組分類(lèi)變化
（2）宏基因組分析表明由接種物引起的根際微生物組變化僅限于早期階段
宏基因組分析深入了解根際微生物組之間的功能差異，結(jié)果表明接種處理誘導(dǎo)的根際微生物組的功能水平變化僅限于早期階段。
圖2：根際微生物組的功能
（3）RNA-seq分析顯示微生物誘導(dǎo)的根系基因表達(dá)變化選擇性地維持到后期
研究人員利用RNA-seq來(lái)分析在接種和未接種土壤中生長(zhǎng)的植物在早期和后期的基因表達(dá)差異模式。結(jié)合結(jié)果顯示，在早期階段檢測(cè)到大多數(shù)差異表達(dá)基因（DEG），且在后期顯著富集。結(jié)果表明微生物誘導(dǎo)的根系基因表達(dá)變化選擇性地維持到后期。
（4）WGBS+RNA-seq分析揭示接種后的DNA甲基化修飾響應(yīng)影響根系的基因表達(dá)
為檢測(cè)接種是否影響根系中的DNA甲基化，研究人員進(jìn)行了DNA甲基化的WGBS分析。結(jié)果表明，在植物與微生物的互作過(guò)程中，某些區(qū)域的DNA甲基化變化從開(kāi)始到后期都保持不變�；谥丿B的差異表達(dá)基因（DEG）和差異甲基化區(qū)域（DMR）聯(lián)合分析基因表達(dá)變化和DNA甲基化水平之間的相關(guān)性。數(shù)據(jù)結(jié)果表明，在菌株P(guān)GP5/PGP41和P.americana植物之間的相互作用中，基因轉(zhuǎn)錄部分由DNA甲基化調(diào)控。
（5）qPCR等驗(yàn)證分析揭示DNA甲基化變化與接種誘導(dǎo)的P.americana生長(zhǎng)促進(jìn)相關(guān)
通過(guò)qPCR對(duì) 16S rRNA基因的拷貝數(shù)進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示兩種接種物早期都存在于根際土壤中，后期從根際土壤中清除，沒(méi)有接種物在根部定殖。通過(guò)熒光原位雜交（FISH）、綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記菌株和16S rRNA基因擴(kuò)增進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)論。表明根際微生物組變化和根系接種物的定殖都不是植物促生過(guò)程所必需的。在根系接種后引起的DNA甲基化修飾會(huì)影響與PGPB誘導(dǎo)的促生相關(guān)基因表達(dá)，并且接種誘導(dǎo)的DNA甲基化模式變化大大阻礙植物促生過(guò)程�？傊�，結(jié)果表明PGPB誘導(dǎo)的根系DNA甲基化修飾介導(dǎo)了促進(jìn)過(guò)程，并且這些修飾在從微生物組中去除接種物后仍具有此功能。
結(jié)論：
這項(xiàng)研究提出了一種新的機(jī)制，PGPB在根系誘導(dǎo)的DNA甲基化修飾介導(dǎo)了植物促生過(guò)程，而且這些甲基化修飾在接種物消亡后仍然具有促生功能。這為微生物-植物的互作提供了重要的新見(jiàn)解，并為植物微生物組工程提供新的策略，超越了“維持土壤中接種物持久性的”觀(guān)點(diǎn)。
圖6：PGPB和植物之間由DNA甲基化和根系募集介導(dǎo)的兩步互作示意圖
易基因小結(jié)：
本研究通過(guò)16S rRNA 擴(kuò)增子測(cè)序、宏基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序、WGBS、RNA-seq等多組學(xué)技術(shù)對(duì)根際復(fù)雜互作關(guān)系進(jìn)行綜合了研究。擴(kuò)增子測(cè)序和宏基因組測(cè)序分析根際微生物組在分類(lèi)學(xué)和功能水平上的變化。轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化測(cè)序分析根際根系在轉(zhuǎn)錄和表觀(guān)遺傳學(xué)水平上的變化。發(fā)現(xiàn)PGPB通過(guò)調(diào)控植物根際DNA甲基化而長(zhǎng)效促進(jìn)植物生長(zhǎng)的新機(jī)制，為PGPB影響根際微生物組提供新的思路。
參考文獻(xiàn)：
DOI:10.1186/s40168-022-01236-9
2022年02月24日，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)沈振國(guó)和蔣建東教授團(tuán)隊(duì)合作在期刊《Microbiome》（IF:14.65/1區(qū)）發(fā)表了題為“Long-term effect of epigenetic modification in plant–microbe interactions: modification of DNA methylation induced by plant growth-promoting bacteria mediates promotion process”的最新研究成果。該研究通過(guò)多組學(xué)分析探討了植物、土壤微生物組、植物促生菌之間的復(fù)雜互作關(guān)系，發(fā)現(xiàn)植物促生菌（plant growth-promoting bacteria,PGPB）通過(guò)調(diào)控植物根際DNA甲基化而長(zhǎng)效促進(jìn)植物生長(zhǎng)的新機(jī)制，首次提出PGPB-植物-微生物組互作的二階段模型，為PGPB影響根際微生物組提供新的思路。
標(biāo)題：表觀(guān)遺傳修飾對(duì)植物-微生物互作的長(zhǎng)效影響：PGPB誘導(dǎo)的DNA甲基化修飾介導(dǎo)促進(jìn)過(guò)程
期刊：Microbiome
影響因子：IF 14.65/1區(qū)
技術(shù)平臺(tái)： 16S rRNA 擴(kuò)增子測(cè)序、宏基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序、WGBS、RNA-seq、qRT-PCR（易基因均可提供）
背景：
土壤微生物群被認(rèn)為是下一次綠色革命的基石，而PGPB是微生物組工程的關(guān)鍵。然而，將植物有益微生物從發(fā)現(xiàn)到農(nóng)業(yè)應(yīng)用仍然具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)橛幸婢昱c原生土壤中的植物間的互作機(jī)制在很大程度上還未知。越來(lái)越多的研究表明，微生物組引入的菌株通常會(huì)在土壤中被消除；而其他一些研究報(bào)告指出，使用PGPB作為接種物可以顯著促進(jìn)植物生長(zhǎng)。這種矛盾表明需要更深入了解微生物誘導(dǎo)的生長(zhǎng)促進(jìn)機(jī)制。
材料方法
土壤：從表層土壤（0-15 cm深度）采集，去除植物碎片和石頭，在實(shí)驗(yàn)室4°C儲(chǔ)存直至使用。
菌株：芽孢桿菌屬PGP5和節(jié)桿菌屬PGP41（Bacillus sp. PGP5 and Arthrobacter sp. PGP41）。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
將對(duì)照組（Ste）和經(jīng)DNA甲基化抑制劑Zebularine（Zeb）處理的美洲陸商（Phytolacca americana）植物種至PGP5（接種菌株P(guān)GP5）、PGP41（接種菌株P(guān)GP41）和CK（滅菌）土壤中。所有處理一式三份進(jìn)行。在接種后0,3,7,15,21,30天對(duì)植物和根際土壤進(jìn)行取樣。將樣品在液氮中冷凍，保存在–80°C直至分析。
采用多組學(xué)方法對(duì)根際復(fù)雜互作關(guān)系進(jìn)行綜合研究。分別通過(guò)擴(kuò)增子和宏基因組測(cè)序分析根際微生物組在分類(lèi)學(xué)和功能水平上的變化。分別通過(guò)轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化測(cè)序分析根際根系在轉(zhuǎn)錄和表觀(guān)遺傳學(xué)水平上的變化。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖
結(jié)果：
研究人員展示了在去除土壤中的PGPB接種物后，PGPB誘導(dǎo)的長(zhǎng)期植物促生作用，并探討了外源接種物、內(nèi)源微生物組和植物之間的三種相互作用，這是植物促生過(guò)程的關(guān)鍵要素。研究發(fā)現(xiàn)根際微生物組的組成主要受植物發(fā)育驅(qū)動(dòng)，根系募集大大減弱了接種物對(duì)根際微生物組的影響。根際微生物組變化和根系接種物定殖都不是促進(jìn)植物生長(zhǎng)的必要條件。在根系接種后引起的DNA甲基化修飾會(huì)影響與PGPB誘導(dǎo)的促生相關(guān)基因表達(dá)，并且接種誘導(dǎo)的DNA甲基化模式變化大大削弱了植物促生作用。總之，結(jié)果表明PGPB誘導(dǎo)的根系DNA甲基化修飾介導(dǎo)了促生過(guò)程，并且這些修飾在從微生物組中去除接種物后仍具有此功能。
關(guān)鍵圖形：
研究發(fā)現(xiàn)，根際微生物組的組成主要由植物的發(fā)育驅(qū)動(dòng)，表明根際分隔可能對(duì)根際微生物組具有募集效應(yīng)，其在根系與特定細(xì)菌之間形成密切關(guān)系后穩(wěn)定了根際微生物組。
圖1：根系誘導(dǎo)的根際微生物組分類(lèi)變化
（2）宏基因組分析表明由接種物引起的根際微生物組變化僅限于早期階段
宏基因組分析深入了解根際微生物組之間的功能差異，結(jié)果表明接種處理誘導(dǎo)的根際微生物組的功能水平變化僅限于早期階段。
圖2：根際微生物組的功能
（3）RNA-seq分析顯示微生物誘導(dǎo)的根系基因表達(dá)變化選擇性地維持到后期
研究人員利用RNA-seq來(lái)分析在接種和未接種土壤中生長(zhǎng)的植物在早期和后期的基因表達(dá)差異模式。結(jié)合結(jié)果顯示，在早期階段檢測(cè)到大多數(shù)差異表達(dá)基因（DEG），且在后期顯著富集。結(jié)果表明微生物誘導(dǎo)的根系基因表達(dá)變化選擇性地維持到后期。
圖3：根際微生物組誘導(dǎo)的根系基因表達(dá)譜變化
（4）WGBS+RNA-seq分析揭示接種后的DNA甲基化修飾響應(yīng)影響根系的基因表達(dá)
為檢測(cè)接種是否影響根系中的DNA甲基化，研究人員進(jìn)行了DNA甲基化的WGBS分析。結(jié)果表明，在植物與微生物的互作過(guò)程中，某些區(qū)域的DNA甲基化變化從開(kāi)始到后期都保持不變�；谥丿B的差異表達(dá)基因（DEG）和差異甲基化區(qū)域（DMR）聯(lián)合分析基因表達(dá)變化和DNA甲基化水平之間的相關(guān)性。數(shù)據(jù)結(jié)果表明，在菌株P(guān)GP5/PGP41和P.americana植物之間的相互作用中，基因轉(zhuǎn)錄部分由DNA甲基化調(diào)控。
圖4：DNA甲基化譜變化和與基因表達(dá)的相關(guān)性
（5）qPCR等驗(yàn)證分析揭示DNA甲基化變化與接種誘導(dǎo)的P.americana生長(zhǎng)促進(jìn)相關(guān)
通過(guò)qPCR對(duì) 16S rRNA基因的拷貝數(shù)進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示兩種接種物早期都存在于根際土壤中，后期從根際土壤中清除，沒(méi)有接種物在根部定殖。通過(guò)熒光原位雜交（FISH）、綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記菌株和16S rRNA基因擴(kuò)增進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)論。表明根際微生物組變化和根系接種物的定殖都不是植物促生過(guò)程所必需的。在根系接種后引起的DNA甲基化修飾會(huì)影響與PGPB誘導(dǎo)的促生相關(guān)基因表達(dá)，并且接種誘導(dǎo)的DNA甲基化模式變化大大阻礙植物促生過(guò)程�？傊�，結(jié)果表明PGPB誘導(dǎo)的根系DNA甲基化修飾介導(dǎo)了促進(jìn)過(guò)程，并且這些修飾在從微生物組中去除接種物后仍具有此功能。
圖5：DNA甲基化抑制劑會(huì)阻礙接種菌株P(guān)GP41和PGP5誘導(dǎo)的P.americana促生
結(jié)論：
這項(xiàng)研究提出了一種新的機(jī)制，PGPB在根系誘導(dǎo)的DNA甲基化修飾介導(dǎo)了植物促生過(guò)程，而且這些甲基化修飾在接種物消亡后仍然具有促生功能。這為微生物-植物的互作提供了重要的新見(jiàn)解，并為植物微生物組工程提供新的策略，超越了“維持土壤中接種物持久性的”觀(guān)點(diǎn)。
圖6：PGPB和植物之間由DNA甲基化和根系募集介導(dǎo)的兩步互作示意圖
易基因小結(jié)：
本研究通過(guò)16S rRNA 擴(kuò)增子測(cè)序、宏基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序、WGBS、RNA-seq等多組學(xué)技術(shù)對(duì)根際復(fù)雜互作關(guān)系進(jìn)行綜合了研究。擴(kuò)增子測(cè)序和宏基因組測(cè)序分析根際微生物組在分類(lèi)學(xué)和功能水平上的變化。轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化測(cè)序分析根際根系在轉(zhuǎn)錄和表觀(guān)遺傳學(xué)水平上的變化。發(fā)現(xiàn)PGPB通過(guò)調(diào)控植物根際DNA甲基化而長(zhǎng)效促進(jìn)植物生長(zhǎng)的新機(jī)制，為PGPB影響根際微生物組提供新的思路。
參考文獻(xiàn)：
DOI:10.1186/s40168-022-01236-9
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