m5C甲基化研究揭示mRNA m5C對(duì)維持果蠅生殖干細(xì)胞發(fā)育的分子機(jī)制
2020年02月18日，Stower研究所解亭教授團(tuán)隊(duì)與南方科技大學(xué)李思思團(tuán)隊(duì)合作研究發(fā)現(xiàn)果蠅的YPS蛋白通過(guò)優(yōu)先結(jié)合帶有m5C修飾的RNA，從而促進(jìn)果蠅卵巢生殖干細(xì)胞的發(fā)育。該成果以“Drosophila YBX1 homolog YPS promotes ovarian germ line stem cell development by preferentially recognizing 5-methylcytosine RNAs”為題在線發(fā)表在《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》（PNAS）（IF 11.205）期刊上。
摘要：
m5C是一種存在于tRNA和rRNA中的RNA修飾，最近在mRNA中發(fā)現(xiàn)。雖然有人提出m5C RNA修飾可以調(diào)節(jié)多種生物學(xué)功能，但m5C RNA修飾是否會(huì)影響成體干細(xì)胞發(fā)育尚不清楚。在本研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)YPS蛋白（Ypsilon schachtel）是人Y-框結(jié)合蛋白1(Y box binding protein 1 ,YBX1)的人源同類蛋白，可以通過(guò)優(yōu)先結(jié)合帶有m5C修飾的RNA，從而促進(jìn)果蠅卵巢生殖干細(xì)胞（GSC）的維持、增殖和分化。遺傳學(xué)證明YPS在果蠅卵巢中具有GSC維持、增殖和分化功能，人YBX1可以在功能上替代YPS支持GSC正常發(fā)育。YPS和YBX1的保守冷休克結(jié)構(gòu)域（cold-shock domains,CSD）在體外優(yōu)先與m5C RNA結(jié)合。此外，YPS還優(yōu)先與生殖細(xì)胞中帶有m5C修飾的RNA（包括mRNAs）結(jié)合。YBX1 CSD-RNA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)表明，疏水相互作用和氫鍵對(duì)m5C結(jié)合至關(guān)重要。RNA結(jié)合缺失突變YPS和YBX1蛋白表達(dá)會(huì)阻礙GSC發(fā)育。綜上所述，研究結(jié)果表明m5C RNA修飾在成人干細(xì)胞發(fā)育中起著重要作用。
背景：
近幾年，由于表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)的興起，m5C作為mRNA中除 m6A之外另一種廣泛存在的修飾，引起了研究人員們的關(guān)注。然而，其調(diào)控細(xì)胞發(fā)育和分化機(jī)制的機(jī)理目前尚不清楚。
研究材料：
室溫條件下，在標(biāo)準(zhǔn)玉米粉/糖蜜/瓊脂培養(yǎng)基上飼養(yǎng)和雜交果蠅。為最大限度提高shRNA和轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平，在分析卵巢表型之前，將新羽化的果蠅在29°C條件下培養(yǎng)2周。取卵巢組織分離RNA用于研究。
結(jié)果：
（1）YPS促進(jìn)果蠅卵巢的GSC維持，增殖和分化
研究人員們首先發(fā)現(xiàn)YPS蛋白缺失的2周齡果蠅卵巢干細(xì)胞顯現(xiàn)出發(fā)育延遲，增值變慢的現(xiàn)象，提示該蛋白對(duì)于果蠅生殖干細(xì)胞的維持，增殖以及分化具有重要作用。由于YPS的人源同類蛋白YBX1與mRNA m5C甲基化酶NSUN2共定位于外泌體中，且YPS本身含有能夠結(jié)合核酸的保守的cold-shock結(jié)構(gòu)域，研究團(tuán)隊(duì)推測(cè)YPS可能通過(guò)結(jié)合含有甲基化的mRNA來(lái)行使功能。
（2）人YBX1可以在功能上取代YPS，促進(jìn)果蠅卵巢GSC發(fā)育
為了驗(yàn)證推測(cè)，研究團(tuán)隊(duì)首先在YPS缺失的果蠅生殖干細(xì)胞中回補(bǔ)表達(dá)人源的同類蛋白YBX1，發(fā)現(xiàn)YBX1可以替代YPS促進(jìn)果蠅生殖干細(xì)胞正常發(fā)育，證明兩個(gè)同源蛋白在功能上具有保守性。同時(shí)通過(guò)Flag-pulldown，免疫共沉淀以及高通量測(cè)序的方法發(fā)現(xiàn)YPS確實(shí)能在體內(nèi)結(jié)合更多含有m5C修飾的mRNA。
圖2：YPS優(yōu)先與生殖細(xì)胞中帶有m5C修飾的RNA結(jié)合
（3）YBX1-CSD主要通過(guò)疏水相互作用對(duì)帶有m5C修飾的RNA優(yōu)先結(jié)合
研究人員利用ITC以及蛋白晶體結(jié)構(gòu)解析等技術(shù)，對(duì)比YBX1蛋白結(jié)合甲基化修飾的RNA以及非甲基化修飾的RNA的高分辨率復(fù)合物結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在YPS和YBX1中高度保守的4個(gè)氨基酸（Trp65、Phe74、Phe85、His87）對(duì)于識(shí)別和結(jié)合甲基化修飾的RNA至關(guān)重要。其中，RNA甲基化增強(qiáng)了RNA與蛋白之間的疏水相互作用，確保YPS和YBX1在體內(nèi)與甲基化的RNA具有更高親和力。
（4）RNA結(jié)合缺失突變YBX1和YPS蛋白表達(dá)嚴(yán)重打亂GSC發(fā)育
功能實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)將這些關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行缺失突變之后，YBX1無(wú)法與RNA結(jié)合。不能結(jié)合RNA的YPS突變體W65A，F(xiàn)74A以及F85A表現(xiàn)為顯性失活，會(huì)打亂果蠅生殖干細(xì)胞的發(fā)育。結(jié)果表明，YBX1和YPS中的Trp65，Phe74和Phe85對(duì)其體內(nèi)功能至關(guān)重要。
易基因小結(jié)：
本研究結(jié)果表明，YPS通過(guò)優(yōu)先識(shí)別帶有m5C修飾的RNA來(lái)調(diào)節(jié)翻譯、剪接和穩(wěn)定性，從而促進(jìn)果蠅卵巢中GSC的發(fā)育，揭示了其作為mRNA m5C的結(jié)合蛋白來(lái)影響生殖干細(xì)胞發(fā)育的分子機(jī)制。同時(shí)，由于YPS/YBX家族蛋白功能從果蠅到人類都是保守的，研究驗(yàn)證了人源YBX1蛋白可以替代果蠅YPS蛋白在果蠅卵巢干細(xì)胞中的作用，暗示其可能在人類干細(xì)胞中具有類似作用，果蠅卵巢或許可以分析人YBX家族蛋白和m5C修飾在生殖細(xì)胞發(fā)育中的功能，為未來(lái)的人類干細(xì)胞治療提出了可能的研究方向。
此前，易基因?qū)Π唏R魚m5C修飾在生理和病理進(jìn)程中的重要調(diào)控作用、單堿基分辨率下分析人類膀胱尿路上皮癌(UCB)樣本中mRNA的m5C修飾、m5C修飾在哺乳動(dòng)物mRNA出核和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用、重亞硫酸鹽處理結(jié)合高通量NGS策略，單堿基分辨率檢測(cè)人細(xì)胞(h)m5C修飾分布等m5C研究成果進(jìn)行了解讀：m5C RNA甲基化測(cè)序技術(shù)---從mRNA到全轉(zhuǎn)錄組（mRNA+lncRNA+tRNA）m5C單堿基分辨檢測(cè)，期待更多m5C甲基化修飾功能調(diào)控研究成果。
關(guān)于m5C甲基化測(cè)序
易基因提供適用于不同科研需求的m5C甲基化測(cè)序技術(shù)：
技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
研究方向：
參考文獻(xiàn)：
摘要：
m5C是一種存在于tRNA和rRNA中的RNA修飾，最近在mRNA中發(fā)現(xiàn)。雖然有人提出m5C RNA修飾可以調(diào)節(jié)多種生物學(xué)功能，但m5C RNA修飾是否會(huì)影響成體干細(xì)胞發(fā)育尚不清楚。在本研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)YPS蛋白（Ypsilon schachtel）是人Y-框結(jié)合蛋白1(Y box binding protein 1 ,YBX1)的人源同類蛋白，可以通過(guò)優(yōu)先結(jié)合帶有m5C修飾的RNA，從而促進(jìn)果蠅卵巢生殖干細(xì)胞（GSC）的維持、增殖和分化。遺傳學(xué)證明YPS在果蠅卵巢中具有GSC維持、增殖和分化功能，人YBX1可以在功能上替代YPS支持GSC正常發(fā)育。YPS和YBX1的保守冷休克結(jié)構(gòu)域（cold-shock domains,CSD）在體外優(yōu)先與m5C RNA結(jié)合。此外，YPS還優(yōu)先與生殖細(xì)胞中帶有m5C修飾的RNA（包括mRNAs）結(jié)合。YBX1 CSD-RNA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)表明，疏水相互作用和氫鍵對(duì)m5C結(jié)合至關(guān)重要。RNA結(jié)合缺失突變YPS和YBX1蛋白表達(dá)會(huì)阻礙GSC發(fā)育。綜上所述，研究結(jié)果表明m5C RNA修飾在成人干細(xì)胞發(fā)育中起著重要作用。
背景：
近幾年，由于表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)的興起，m5C作為mRNA中除 m6A之外另一種廣泛存在的修飾，引起了研究人員們的關(guān)注。然而，其調(diào)控細(xì)胞發(fā)育和分化機(jī)制的機(jī)理目前尚不清楚。
研究材料：
室溫條件下，在標(biāo)準(zhǔn)玉米粉/糖蜜/瓊脂培養(yǎng)基上飼養(yǎng)和雜交果蠅。為最大限度提高shRNA和轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平，在分析卵巢表型之前，將新羽化的果蠅在29°C條件下培養(yǎng)2周。取卵巢組織分離RNA用于研究。
結(jié)果：
（1）YPS促進(jìn)果蠅卵巢的GSC維持，增殖和分化
研究人員們首先發(fā)現(xiàn)YPS蛋白缺失的2周齡果蠅卵巢干細(xì)胞顯現(xiàn)出發(fā)育延遲，增值變慢的現(xiàn)象，提示該蛋白對(duì)于果蠅生殖干細(xì)胞的維持，增殖以及分化具有重要作用。由于YPS的人源同類蛋白YBX1與mRNA m5C甲基化酶NSUN2共定位于外泌體中，且YPS本身含有能夠結(jié)合核酸的保守的cold-shock結(jié)構(gòu)域，研究團(tuán)隊(duì)推測(cè)YPS可能通過(guò)結(jié)合含有甲基化的mRNA來(lái)行使功能。
圖1：YPS本質(zhì)上是為了促進(jìn)GSC維持、增殖和分化
（2）人YBX1可以在功能上取代YPS，促進(jìn)果蠅卵巢GSC發(fā)育
為了驗(yàn)證推測(cè)，研究團(tuán)隊(duì)首先在YPS缺失的果蠅生殖干細(xì)胞中回補(bǔ)表達(dá)人源的同類蛋白YBX1，發(fā)現(xiàn)YBX1可以替代YPS促進(jìn)果蠅生殖干細(xì)胞正常發(fā)育，證明兩個(gè)同源蛋白在功能上具有保守性。同時(shí)通過(guò)Flag-pulldown，免疫共沉淀以及高通量測(cè)序的方法發(fā)現(xiàn)YPS確實(shí)能在體內(nèi)結(jié)合更多含有m5C修飾的mRNA。
圖2：YPS優(yōu)先與生殖細(xì)胞中帶有m5C修飾的RNA結(jié)合
（3）YBX1-CSD主要通過(guò)疏水相互作用對(duì)帶有m5C修飾的RNA優(yōu)先結(jié)合
研究人員利用ITC以及蛋白晶體結(jié)構(gòu)解析等技術(shù)，對(duì)比YBX1蛋白結(jié)合甲基化修飾的RNA以及非甲基化修飾的RNA的高分辨率復(fù)合物結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在YPS和YBX1中高度保守的4個(gè)氨基酸（Trp65、Phe74、Phe85、His87）對(duì)于識(shí)別和結(jié)合甲基化修飾的RNA至關(guān)重要。其中，RNA甲基化增強(qiáng)了RNA與蛋白之間的疏水相互作用，確保YPS和YBX1在體內(nèi)與甲基化的RNA具有更高親和力。
圖3：果蠅YPS和人YBX1的CSD優(yōu)先與帶有m5C修飾的RNA結(jié)合
（4）RNA結(jié)合缺失突變YBX1和YPS蛋白表達(dá)嚴(yán)重打亂GSC發(fā)育
功能實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)將這些關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行缺失突變之后，YBX1無(wú)法與RNA結(jié)合。不能結(jié)合RNA的YPS突變體W65A，F(xiàn)74A以及F85A表現(xiàn)為顯性失活，會(huì)打亂果蠅生殖干細(xì)胞的發(fā)育。結(jié)果表明，YBX1和YPS中的Trp65，Phe74和Phe85對(duì)其體內(nèi)功能至關(guān)重要。
圖4：RNA結(jié)合缺失YPS和YBX1突變的種系特異性表達(dá)嚴(yán)重干擾GSC發(fā)育
易基因小結(jié)：
本研究結(jié)果表明，YPS通過(guò)優(yōu)先識(shí)別帶有m5C修飾的RNA來(lái)調(diào)節(jié)翻譯、剪接和穩(wěn)定性，從而促進(jìn)果蠅卵巢中GSC的發(fā)育，揭示了其作為mRNA m5C的結(jié)合蛋白來(lái)影響生殖干細(xì)胞發(fā)育的分子機(jī)制。同時(shí)，由于YPS/YBX家族蛋白功能從果蠅到人類都是保守的，研究驗(yàn)證了人源YBX1蛋白可以替代果蠅YPS蛋白在果蠅卵巢干細(xì)胞中的作用，暗示其可能在人類干細(xì)胞中具有類似作用，果蠅卵巢或許可以分析人YBX家族蛋白和m5C修飾在生殖細(xì)胞發(fā)育中的功能，為未來(lái)的人類干細(xì)胞治療提出了可能的研究方向。
此前，易基因?qū)Π唏R魚m5C修飾在生理和病理進(jìn)程中的重要調(diào)控作用、單堿基分辨率下分析人類膀胱尿路上皮癌(UCB)樣本中mRNA的m5C修飾、m5C修飾在哺乳動(dòng)物mRNA出核和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用、重亞硫酸鹽處理結(jié)合高通量NGS策略，單堿基分辨率檢測(cè)人細(xì)胞(h)m5C修飾分布等m5C研究成果進(jìn)行了解讀：m5C RNA甲基化測(cè)序技術(shù)---從mRNA到全轉(zhuǎn)錄組（mRNA+lncRNA+tRNA）m5C單堿基分辨檢測(cè)，期待更多m5C甲基化修飾功能調(diào)控研究成果。
關(guān)于m5C甲基化測(cè)序
易基因提供適用于不同科研需求的m5C甲基化測(cè)序技術(shù)：
- 常規(guī)mRNA m5C甲基化測(cè)序（RNA-BS）：
- 分離后首先通過(guò)亞硫酸鹽處理，非甲基化的C轉(zhuǎn)變?yōu)閁，m5C修飾的堿基保持不變，結(jié)合高通量測(cè)序，可以對(duì)RNA上的每一個(gè)C堿基修飾進(jìn)行定位與定量。
- 常規(guī)mRNA +lncRNA m5C甲基化測(cè)序（lncRNA-BS）：
技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
- 高深度：超高深度重亞硫酸鹽處理，檢測(cè)準(zhǔn)確性極高；
- 高通量：結(jié)合高通量NGS，全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)檢測(cè)；
- 單堿基：?jiǎn)螇A基分辨率，快速檢測(cè)和分析RNA中的m5C。
- 高準(zhǔn)確：精確的檢測(cè)mRNA等每一個(gè)C堿基的的修飾水平。
研究方向：
- 與m6A甲基化類似，m5C甲基化已被證明與腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、代謝性疾病、病毒感染以及個(gè)體發(fā)育等密切相關(guān)。
- 此外，RNA甲基化（m5C）與人類疾病密切相關(guān)，其功能涉及調(diào)控干細(xì)胞應(yīng)激、細(xì)胞毒性應(yīng)激、mRNA出核和植物細(xì)胞發(fā)育及基因表達(dá)等方面。
參考文獻(xiàn)：
- doi: 10.1073/pnas.1910862117.
- 南方科技大學(xué)：https://science.sustech.edu.cn/portal/Article/index?id=504&cid=10&year=2020&nav_id=95
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