關(guān)于細(xì)胞的程序性死亡的相關(guān)研究一直是生命科學(xué)的熱門領(lǐng)域，無論是持續(xù)火熱的"鐵死亡"  (推文：鐵死亡是什么，如何檢測？您要的 “一文通” 來了)。還是正在生信領(lǐng)域大方異彩的 “銅死亡” (推文：空降 "熱搜" 銅死亡丨解鎖細(xì)胞死亡新方式)，都涉及到 "離子轉(zhuǎn)運"。在轉(zhuǎn)運過程中，溶質(zhì)載體 (Solute Carriers, SLC) 轉(zhuǎn)運蛋白家族作為重要的膜轉(zhuǎn)運蛋白家族，它們對葡萄糖、氨基酸和金屬離子的轉(zhuǎn)運有著重要的影響 (圖 1)^[1]。

圖 1. SLC 蛋白家族對不同離子以及氨基酸等轉(zhuǎn)運^[1]

 

 

SLC 家族成員 SLC7A11 轉(zhuǎn)運蛋白在維持細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平和保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡方面具有重要作用，具有公認(rèn)的促生存作用^[3]。但有研究表明，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞在葡萄糖剝奪條件下，通過 System Xc- (其中 SLC7A11 為催化亞基) 攝取胱氨酸會迅速誘導(dǎo) NADPH 耗竭、活性氧物質(zhì)積累和細(xì)胞死亡。

2020 年甘波誼團(tuán)隊在 Nature Cell Biology 發(fā)表的文章也表明，葡萄糖饑餓條件下，高 SLC7A11 表達(dá)反而促進(jìn)細(xì)胞死亡，SLC7A11 就像是調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原平衡和細(xì)胞死亡/存活方面的雙刃劍^[4]。

■ SLC7A11 高表達(dá)為何會 “促” 死亡？

這是因為胱氨酸是種不溶性氨基酸，為了防止細(xì)胞內(nèi)高度不溶性胱氨酸的毒性積聚， SLC7A11^high 細(xì)胞需要迅速將胱氨酸還原為半胱氨酸，而這個過程需要從葡萄糖-戊糖磷酸途徑 (PPP) 獲得大量 NADPH，這會對細(xì)胞NADPH 庫會造成大量消耗，并使此類細(xì)胞產(chǎn)生葡萄糖和戊糖磷酸途徑 (PPP) 依賴性     (如圖 2)   ^[4,5]。因此，當(dāng)葡萄糖供應(yīng)限制，氧化還原力不足， SLC7A11^high 細(xì)胞內(nèi)的胱氨酸或其他二硫化物分子的異常積累，誘發(fā)二硫化物應(yīng)激觸發(fā)細(xì)胞死亡。  今年 2 月，甘波誼團(tuán)隊發(fā)表的 Actin cytoskeleton vulnerability to disulfide stress mediates disulfidptosis 一文更加詳細(xì)闡明了這一死亡機制，研究表明肌動蛋白細(xì)胞骨架對二硫化應(yīng)激的敏感性介導(dǎo)了雙硫死亡 (disulfidptosis)，并提出了在癌癥治療中靶向二硫化的治療策略。 

雙硫死亡是一種不同于鐵死亡，凋亡等的新型死亡方式，在 SLC7A11^high 細(xì)胞中，鐵死亡，凋亡，細(xì)胞壞死以及自噬抑制劑都不能挽救葡萄糖饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡 (圖 3a-b), 但二硫應(yīng)激的還原劑，如二硫蘇糖醇 (DTT)、β-巰基乙醇 (2ME) 和 TCEP 可以完全抑制 SLC7A11^high 細(xì)胞中葡萄糖饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡 (圖 3d)。此外，硫醇氧化劑(二胺和馬來酸二乙酯)促進(jìn) SLC7A11^high 細(xì)胞在葡萄糖饑餓下的細(xì)胞死亡，并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)二硫分子的急劇積累(如胱氨酸和谷氨酰胱氨酸，經(jīng)二胺處理后進(jìn)一步增加) (圖 3c)。透射電鏡分析顯示，在葡萄糖饑餓導(dǎo)致 SLC7A11^high 細(xì)胞種胱氨酸在細(xì)胞質(zhì)中積聚 (圖 3e)。以上結(jié)果表明二硫脅迫引起的細(xì)胞死亡，與鐵死亡，細(xì)胞凋亡等都不同，那么其特征到底是什么？ 

 

 

 

圖 3. 葡萄糖饑餓條件下的細(xì)胞死亡方式^[5] 

a. SLC7A11-high 細(xì)胞的用 DFO, Fer-1, Z-VAD, Nec-1, Nec-2 和 CQ 處理后的細(xì)胞死亡情況。b. 過表達(dá) SLC7A11 的細(xì)胞在無葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)中用 Z-VAD, Fer-1 和 TCEP 處理指定時間。c. UMRC6 細(xì)胞在含或不含 DTT, 2ME 或 TCEP的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。d. UMRC6 細(xì)胞內(nèi)胱氨酸和谷氨酰胱氨酸的積累。e. UMRC6 細(xì)胞的典型透射電鏡圖像。

 作者團(tuán)隊假設(shè)，在葡萄糖饑餓條件下，SLC7A11 高細(xì)胞的 NADPH 消耗和二硫應(yīng)激的增加誘導(dǎo)氧化還原敏感蛋白中二硫鍵的生成 (在正常條件下，細(xì)胞質(zhì)的還原環(huán)境阻止胞質(zhì)蛋白形成二硫鍵)，這可能會破壞相應(yīng)的氧化蛋白的活性或功能，從而損害細(xì)胞活力。

為了驗證這一假設(shè)，作者團(tuán)隊對氨基酸進(jìn)行穩(wěn)定同位素標(biāo)記，量化葡萄糖饑餓誘導(dǎo)的 SLC7A11^high 細(xì)胞中的二硫化物蛋白質(zhì)組改變 (圖 4a)。正向和反向標(biāo)記分析確定了 90 個半胱氨酸位點。此外，基因本體分析表明，在葡萄糖饑餓誘導(dǎo)的二硫鍵的蛋白質(zhì)中，肌動蛋白細(xì)胞骨架和細(xì)胞粘附相關(guān)的生物過程或途徑顯著富集 (圖 4c)，作者團(tuán)隊還發(fā)現(xiàn)了至少 17 個肌動蛋白細(xì)胞骨架蛋白在葡萄糖饑餓后二硫鍵增加的蛋白中 (圖 4b) 并且這些蛋白質(zhì)中的大多數(shù)包含二硫鍵的半胱氨酸位點 (圖 4d-e)。這表明 SLC7A11^high 細(xì)胞中的葡萄糖饑餓可能誘導(dǎo)肌動蛋白細(xì)胞骨架蛋白中的二硫鍵 (圖 4c)。

圖 4. 葡萄糖饑餓條件下肌動蛋白細(xì)胞骨架蛋白中的二硫鍵形成^[5]

 

由于二硫鍵的形成會影響非還原條件下蛋白質(zhì)的電泳遷移率。作者團(tuán)隊檢測了肌動蛋白細(xì)胞骨架蛋白的遷移率，發(fā)現(xiàn) UMRC6 細(xì)胞在葡萄糖饑餓后，多個肌動蛋白細(xì)胞骨架蛋白表現(xiàn)出較慢的遷移，這表明這些肌動蛋白細(xì)胞骨架蛋白在葡萄糖饑餓條件下形成多個分子間二硫鍵 (圖 5a) 。作者團(tuán)隊還進(jìn)一步研究葡萄糖饑餓后 SLC7A11^high 細(xì)胞的肌動蛋白細(xì)胞骨架動力學(xué)。在含糖培養(yǎng)基的 SLC7A11^high 細(xì)胞中，肌動蛋白絲 (F-肌動蛋白) 主要在細(xì)胞皮質(zhì)和應(yīng)激纖維中；但葡萄糖饑餓會誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)的顯著變化：細(xì)胞收縮和 F-肌動蛋白收縮。F-actin 與膜染料 CellMask 共染色顯示，葡萄糖饑餓會導(dǎo)致 SLC7A11^high 細(xì)胞中 F-肌動蛋白從質(zhì)膜分離 (圖 5b-d)，并且葡萄糖饑餓誘導(dǎo)的這些細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架形態(tài)的變化是 SLC7A11 依賴性的 (圖 5c)，胱氨酸饑餓 、2DG 或 2ME (圖 5f) 處理可以消除這種變化。葡萄糖饑餓誘導(dǎo)的 SLC7A11 高細(xì)胞肌動蛋白骨架蛋白異常二硫鍵可能導(dǎo)致隨后的 F-肌動蛋白收縮和脫離質(zhì)膜。

 

圖 5. 葡萄糖饑餓條件下，異常二硫鍵形成導(dǎo)致的肌動蛋白動力學(xué)^[5]

a-b. 谷胱甘肽化 slc7a11-high 介導(dǎo)的胱氨酸攝取示意圖。c. WT 和 SLC7A11-KO UMRC6 細(xì)胞的無糖培養(yǎng)基中對 F-肌動蛋白進(jìn)行熒光染色。d. 無糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞的 F-肌動蛋白和膜進(jìn)行熒光染色。e. 含葡萄糖、無葡萄糖、葡萄糖和無胱氨酸 (−Glc) 或無胱氨酸 (−Glc) 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對 F-肌動蛋白進(jìn)行熒光染色。F. 2ME 添加在含糖或無糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞中 F-肌動蛋白的熒光染色。 

 

 

以上結(jié)果表明，SLC7A11^high 細(xì)胞中，葡萄糖饑餓誘導(dǎo)肌動蛋白細(xì)胞骨架蛋白的異常二硫鍵，F(xiàn)-肌動蛋白以 SLC7A11 依賴性的方式崩潰。新的死亡機制的鑒定促進(jìn)人們對細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的基本理解，那 “雙硫死亡” 最大的意義何在？   葡萄糖是糖酵解的起始物質(zhì)，由葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白 (GLUT) 家族通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運，靶向葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白 (GLUT) 是是潛在癌癥治療干預(yù)的有趣靶點。甘波誼團(tuán)隊等人在 2020 年的發(fā)表的文章中就發(fā)現(xiàn)高 SLC7A11 表達(dá)的癌細(xì)胞對葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白 GLUT 抑制劑特別敏感。GLUT 抑制劑 KL-11743 或 Bay-876 可有效抑制葡萄糖攝取，與葡萄糖饑餓情況相似。在 SLC7A11 過表達(dá)細(xì)胞中，GLUT1 抑制劑處理增加 NADP+/NADPH比值 (圖 6a,b)，并在 UMRC6 細(xì)胞中引發(fā)強烈的細(xì)胞死亡(圖 6c)。此外，GLUT 抑制會誘導(dǎo)二硫鍵的結(jié)合肌動蛋白骨架蛋白和 F-肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)崩潰。在動物模型中，Bay876 治療降低了 SLC7A11high NCI-H226異種移植瘤的生長 (圖 6d)，Bay -876 處理的腫瘤表現(xiàn)出頻繁的細(xì)胞死亡 (圖 6e)，Bay-876 處理的腫瘤在肌動蛋白細(xì)胞骨架蛋白中表現(xiàn)出更多的二硫鍵結(jié)合。這些結(jié)果表明：GLUT 抑制劑誘導(dǎo) SLC7A11^high  癌細(xì)胞的雙硫狀態(tài)和細(xì)胞死亡，而癌細(xì)胞的雙硫死亡可能是介導(dǎo) GLUT 抑制劑治療 SLC7A11^high 腫瘤的治療效果的關(guān)鍵因素。 

 

  

 

 

■ 小結(jié)

作者團(tuán)隊研究結(jié)果表明在 SLC7A11 高表達(dá)的情況下，葡萄糖饑餓限制 PPP 產(chǎn)生 NADPH 會導(dǎo)致小分子二硫化物 (包括胱氨酸) 大量積累、引起一系列氧化還原缺陷和細(xì)胞死亡。

相關(guān)產(chǎn)品

Necrostatin-1 (Nec-1) 一種有效的能透過血腦屏障的壞死性凋亡 (necroptosis) 抑制劑，Necrostatin-1 (Nec-1) 也是一種 (IDO) 抑制劑。

RSL3 ((1S,3R)-RSL3) 谷胱甘肽過氧化物酶 4 (GPX4) 的抑制劑 (ferroptosis 激動劑)，可降低 GPX4 的表達(dá)

Ferrostatin-1 (Fer-1) 有效的、選擇性的 ferroptosis 抑制劑。Ferrostatin-1 是一種人工合成的抗氧化劑，通過還原機制來防止膜脂的損傷，從而抑制細(xì)胞死亡。具有抗真菌活性。

Chloroquine Chloroquine 是自噬 (autophagy) 和 Toll 樣受體 (TLRs) 的抑制劑。Chloroquine 有效抑制 SARS-CoV-2 (COVID-19) 感染 (EC50=1.13 μM)。

Deferoxamine (Deferoxamine B) 鐵螯合劑 (結(jié)合 Fe(III) 和許多其他金屬陽離子)，被廣泛用于減少鐵在組織中的積累和沉積。

Staurosporine 凋亡誘導(dǎo)劑。是一種有效，ATP 競爭性的，非選擇性蛋白激酶抑制劑

2-Deoxy-D-glucose 葡萄糖類似物，為葡萄糖代謝抑制劑，通過作用于己糖激酶 (hexokinase) 來抑制糖酵解 (glycolysis)。

BAY-876 一種具有口服活性的，選擇性的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白 1 (GLUT1) 抑制劑，IC50 為 2 nM。BAY-876 對 GLUT1 的選擇性是 GLUT2，GLUT3 和 GLUT4 的 130 倍以上。

KL-11743 具有口服活性的葡萄糖競爭性 I 類葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑，抑制 GLUT1，GLUT2，GLUT3 和 GLUT4 的 IC50 值分別為 115 nM，137 nM，90 nM 和 68 nM。KL-11743 特異性阻斷葡萄糖代謝。KL-11743 可與電子傳遞抑制劑協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

參考文獻(xiàn)
1.  Wenxin Song, et al. Solute carrier transporters: the metabolic gatekeepers of immune cells. Acta Pharm Sin B. 2020 Jan;10(1):61-78.  
2.  Xiaoguang Liu, Yilei Zhang , Li Zhuang, et al. NADPH debt drives redox bankruptcy: SLC7A11/xCT-mediated cystine uptake as a double-edged sword in cellular redox regulation . Genes Dis. 2020 Nov 25;8(6):731-745. 
3. Takeo Goji, et al. Cystine uptake through the cystine/glutamate antiporter xCT triggers glioblastoma cell death under glucose deprivation. J Biol Chem. 2017 Dec 1;292(48):19721-19732. 
4. Xiaoguang Liu, Kellen Olszewski, Yilei Zhang, et al. Cystine transporter regulation of pentose phosphate pathway dependency and disulfide stress exposes a targetable metabolic vulnerability in cancer. Nat Cell Biol. 2020 Apr;22(4):476-486.  
5. Xiaoguang Liu, Litong Nie, et al. Actin cytoskeleton vulnerability to disulfide stress mediates disulfidptosis. Nat Cell Biol. 2023 Feb 6.  
6. Pranavi Koppula, Li Zhuang, Boyi Gan. Cystine transporter SLC7A11/xCT in cancer: ferroptosis, nutrient dependency, and cancer therapy.  Protein Cell. 2021 Aug;12(8):599-620.