研究結(jié)果
1. scRNA-seq檢測破骨細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)胞異質(zhì)性
小鼠骨髓細(xì)胞用先用M-CSF培養(yǎng)2d，這些細(xì)胞被進(jìn)一步用M-CSF聯(lián)合RANKL培養(yǎng)3d（圖1a）。本文通過單細(xì)胞測序，分析質(zhì)檢通過的7,228個(gè)細(xì)胞。設(shè)計(jì)了第0天，第1天和第3天三個(gè)分組，分別對應(yīng)2,190、2,649和2,389的細(xì)胞數(shù)�；�于無監(jiān)督聚類方法區(qū)分了12個(gè)cluster，涵蓋以上三個(gè)分組（圖1b）。cluster7只出現(xiàn)在第3天且高表達(dá)破骨細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記基因（Acp5，Ctsk，Mmp9，Nfatc1，Dcstamp，Atp6v0d2）表明cluster7代表成熟的破骨細(xì)胞（圖1b，c）。在相比之下，cluster 1在第0天大量存在，但是在第1天和第3天會消失。cluster 1顯示破骨前體細(xì)胞的標(biāo)志物（Tnfrsf11a,，Csf1r和Cx3cr1），同時(shí)還有破骨細(xì)胞形成的內(nèi)在負(fù)調(diào)節(jié)因子（Irf8, Bcl6和Mafb；圖1b，d，e），這些都提示cluster1中包含了破骨前體細(xì)胞。
 

2. 破骨細(xì)胞分化軌跡
下一步，本文通過Slingshot分析方法進(jìn)行擬時(shí)序分析，該方法基于聚類的12個(gè)cluster預(yù)測它們的分化軌跡。分析結(jié)果表明cluster1經(jīng)過cluster9，cluster3，cluster2和cluster4逐步轉(zhuǎn)化cluster7（圖2a）。在這轉(zhuǎn)化過程中，破骨細(xì)胞基因（Acp5，Ctsk，Mmp9，Dcstamp，Ocstamp和Atp6v0d2）的表達(dá)水平逐漸升高，而骨破骨形成負(fù)調(diào)控因子(Irf8，Bcl6和Mafb)的表達(dá)水平逐漸下調(diào)（圖2b），結(jié)果與bulk RNA-seq 數(shù)據(jù)一致。

接下來，我們使用Slingshot進(jìn)行偽時(shí)間分析，該方法可以基于基于聚類的最小生成樹12預(yù)測分化軌跡。偽時(shí)間分析表明，聚類1通過逐步分化為聚類7，并經(jīng)過聚類9、3、2和4（圖2a）。在這一過程中，破骨細(xì)胞基因（Acp5，Ctsk，Mmp9，Dcstamp，Ocstamp和Atp6v0d2）的表達(dá)水平逐漸升高，而與破骨形成負(fù)調(diào)控因子（Irf8，Bcl6和Mafb）的表達(dá)水平逐漸下調(diào)（圖2b），該結(jié)果與bulk RNA-seq數(shù)據(jù)結(jié)果一致。Itgax（編碼蛋白CD11c）為樹突細(xì)胞（dendritic cell，DC）標(biāo)記基因；而在破骨細(xì)胞發(fā)生的分化軌跡中，Itgax的表達(dá)短暫上調(diào)（圖2c）。這也預(yù)示著破骨前體細(xì)胞表達(dá)特征和DC有相似地方。

有一些研究認(rèn)為DC細(xì)胞就是破骨前體細(xì)胞；但也有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)小鼠即便有成熟DC細(xì)胞缺陷，也不會對破骨細(xì)胞的形成造成影響。為此構(gòu)建基因工程鼠，特異性抑制DC細(xì)胞中Tnfrsf11a的表達(dá)（Tnfrsf11a^flox/ΔCD11c-Cre），該小鼠和對照小鼠（Tnfrsf11a^flox/Δ）相比，破骨細(xì)胞的形成明顯受到抑制；與之相反骨組織的體積、骨小梁的厚度增加（圖2d–h）。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證擬時(shí)序的結(jié)果，本文進(jìn)一步探索了培養(yǎng)第1天的細(xì)胞表面的標(biāo)志物（圖2i）。結(jié)果顯示C5aR1⁺CSF1R⁺細(xì)胞（cluster2和cluster3）和C5aR1⁻CSF1R⁺細(xì)胞（cluster4）轉(zhuǎn)化為破骨細(xì)胞；而C5aR1⁻CSF1R⁻細(xì)胞（cluster6和cluster8）未能分化為破骨細(xì)胞，這表明cluster2、3和4代表了破骨前體細(xì)胞，但cluster6和cluster8不具備分化成破骨細(xì)胞的潛力（圖2j）。這些結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了破骨細(xì)胞分化軌跡，并明確破骨細(xì)胞體外培養(yǎng)中展現(xiàn)的細(xì)胞異質(zhì)性（圖2k）。
 

3. 破骨細(xì)胞形成過程中的逐步生物學(xué)過程
為了闡明破骨細(xì)胞發(fā)生的分步生物學(xué)過程，本文需cluster1、9、3、2、4和7進(jìn)行了GO富集分析（圖3）。cluster1代表第0天的破骨前體細(xì)胞，主要設(shè)計(jì)單核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組表達(dá)包括：髓系白細(xì)胞活化、髓系細(xì)胞分化、吞噬體和Fcγ受體依賴的吞噬細(xì)胞（圖3）。cluster9代表DC樣前體細(xì)胞，富集抗原處理和呈遞相關(guān)（圖3）。cluster3可能代表RANKL誘導(dǎo)的早期破骨前體細(xì)胞，其中包含了膜筏上產(chǎn)生含有RANK復(fù)合體和基于酪氨酸的免疫受體激活信號，這些功能促進(jìn)破骨細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖3）。cluster2主要是破骨前體細(xì)胞增殖激活的代謝功能。cluster4主要涉及能量代謝和末端分化。cluster7主要呈現(xiàn)破骨細(xì)胞的特征，包括骨質(zhì)吸收和內(nèi)吞等功能。
 

4. Cited2作為觸發(fā)破骨細(xì)胞末端分化的分子開關(guān)的鑒定
本文最后還研究了參與調(diào)控破骨細(xì)胞生成的轉(zhuǎn)錄因子。伴隨破骨細(xì)胞形成的過程中有25個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子發(fā)生了顯著的改變。其中Cited2可以調(diào)控一些破骨細(xì)胞形成的核心基因，如Nfatc1和Jdp2。Bulk RNA -seq結(jié)果顯示，當(dāng)敲除Cited表達(dá)，破骨前體細(xì)胞的細(xì)胞周期功能上調(diào)（圖4b）。構(gòu)建基因工程鼠，特異性敲除巨噬前體細(xì)胞的Cited的表達(dá)（Cited2^flox/floxTnfrsf11a-Cre）。工程鼠中破骨細(xì)胞的形成明顯受到抑制（圖4c，d）。流式細(xì)胞儀分析破骨細(xì)胞培養(yǎng)體系的細(xì)胞，結(jié)果顯示Cited2^flox/floxTnfrsf11a-Cre在第一天可以產(chǎn)生CSF1R⁺C5aR1⁺細(xì)胞(即增殖的破骨前體細(xì)胞) ，但在第2天未能繼續(xù)轉(zhuǎn)化CSF1R⁺C5aR1⁻（圖4e）。最終歸納破骨細(xì)胞分化圖，可以看到細(xì)胞逐步改變的狀態(tài)并伴隨的調(diào)整的功能和通路，Cited2的作用位置，同時(shí)還列出每個(gè)cluster的高表達(dá)基因（圖4f）。
 

參考文獻(xiàn)：
sukasaki M, Huynh NC, Okamoto K, et al. Stepwise cell fate decision pathways during osteoclastogenesis at single-cell resolution. Nat Metab. 2020;2(12):1382-1390. doi:10.1038/s42255-020-00318-y