m6A mRNA甲基化修飾調(diào)控CTNNB1促進(jìn)肝母細(xì)胞瘤增殖的機(jī)制研究
2019年12月23日，國(guó)家兒童醫(yī)學(xué)中心（上海）、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心潘秋輝教授團(tuán)隊(duì)在《Molecular Cancer》（IF:41.444/Q1）雜志上發(fā)表了題為“m6A mRNA methylation regulates CTNNB1 to promote the proliferation of hepatoblastoma”的文章，研究通過(guò)MeRIP-seq（m6A-seq）等實(shí)驗(yàn)揭示了m6A甲基化修飾在肝母細(xì)胞瘤（Hepatoblastoma，HB）中的生物學(xué)作用和潛在機(jī)制。為探究RNA m6A甲基化修飾與肝母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制的相關(guān)性奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為肝母細(xì)胞瘤干預(yù)治療提供新的理論基礎(chǔ)。
標(biāo)題：m6A mRNA methylation regulates CTNNB1 to promote the proliferation of hepatoblastoma（m6A甲基化修飾調(diào)控CTNNB1促進(jìn)肝母細(xì)胞瘤增殖）
時(shí)間：2019.12.23
期刊：Molecular Cancer
影響因子：IF 41.444
技術(shù)平臺(tái)：MeRIP-seq、RNA-seq、RT-PCR、Western Blot等
項(xiàng)目設(shè)計(jì)
（1）樣本選取：
HB標(biāo)本和細(xì)胞系使用了來(lái)自25例患者的原發(fā)性HB腫瘤組織及其非腫瘤對(duì)應(yīng)物（鄰近正常組織）。
（2）項(xiàng)目設(shè)計(jì)流程圖：
研究目的
m6A修飾對(duì)mRNA的穩(wěn)定性、剪接和翻譯的調(diào)控具有重要意義。然而，它在癌癥中的作用尚未被詳細(xì)研究，為進(jìn)一步研究m6A修飾在肝母細(xì)胞瘤(HB)中的生物學(xué)作用和潛在機(jī)制，本研究評(píng)估了肝母細(xì)胞瘤(HB)組織中m6A的水平，及其關(guān)鍵催化基因和整體m6A轉(zhuǎn)錄組水平概況。研究結(jié)果表明METTL3是參與異常m6A修飾的主要因素。此外還分析靶基因CTNNB1，探討了甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3在HB中參與調(diào)控CTNNB1的機(jī)制。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
（1）m6A修飾在HB中的潛在作用
研究檢測(cè)了腫瘤和正常組織中的m6A水平，并在腫瘤組織和HB細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了m6A mRNA水平的升高。此外通過(guò)RT-qPCR和Western blotting評(píng)估了m6A writers、erasers 和 readers在腫瘤和鄰近正常肝組織中的表達(dá)。與鄰近正常組織相比，大多數(shù)腫瘤的METTL3、WTAP、FTO和YTHDF2水平顯著上調(diào)。這些結(jié)果證實(shí)了m6A修飾在腫瘤組織中是上調(diào)的。
（2）METTL3、WTAP、FTO、YTHDF2在HB中的功能作用
METTL3、WTAP、FTO、YTHDF2基因的敲除顯著抑制了HB細(xì)胞的增殖，并抑制了其集落形成能力。annexin V-PI雙染檢測(cè)結(jié)果顯示，METTL3、WTAP、FTO、YTHDF2表達(dá)下調(diào)會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡�？紤]到這些基因的催化功能以及m6A修飾的上調(diào)水平，最終選擇METTL3作為候選分子作為HB中m6A異常修飾的標(biāo)記。它與m6A水平呈正相關(guān)，可能是促進(jìn)HB增殖的致癌基因以及m6A甲基轉(zhuǎn)移酶的重要活性成分。
（3）METTL3可能是HB患者診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物
對(duì)25對(duì)HB患者樣本進(jìn)行免疫組化分析。根據(jù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和Pearson s X2檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)HB中METTL3水平升高，這表明在mRNA和蛋白水平上與之前的觀察結(jié)果一致。采用RT-qPCR方法檢測(cè)組織標(biāo)本中METTL3的表達(dá)，根據(jù)中位δ ct值分為高、低組，Kaplan Meier分析顯示，METTL3表達(dá)增加的患者復(fù)發(fā)頻繁，生存期較差。ROC曲線進(jìn)一步證實(shí)了METTL3的診斷價(jià)值，這些結(jié)果表明METTL3可能是HB患者診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。
（4）METTL3促進(jìn)體內(nèi)HB腫瘤生長(zhǎng)
研究人員通過(guò)裸鼠皮下植入實(shí)驗(yàn)分析METTL3敲除對(duì)HB致瘤性的影響。用慢病毒感染Huh6細(xì)胞，表達(dá)針對(duì)METTL3的shRNA (shMETTL3-1)及其陰性對(duì)照(shNC)。RT-qPCR分析證實(shí)，與陰性對(duì)照相比，shMETTL3-1感染Huh6細(xì)胞中METTL3的表達(dá)顯著下調(diào)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中觀察到相對(duì)于非靶shRNA對(duì)照，穩(wěn)定敲除METTL3可以導(dǎo)致腫瘤體積和重量顯著減少。此外研究還證實(shí)了在METTL3敲除HB細(xì)胞Huh6和小鼠腫瘤組織中，CTNNB1下游轉(zhuǎn)錄因子TCF4和靶基因Cyclin D1的表達(dá)降低。這些實(shí)驗(yàn)支持了METTL3在HB腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的致癌作用。
（5）HB中廣泛的m6A修飾及其拓?fù)淠Ｊ?/strong>
對(duì)5個(gè)腫瘤組織和正常組織進(jìn)行m6A-seq分析，發(fā)現(xiàn)五個(gè)腫瘤組均表現(xiàn)出高水平的總m6A。m6A-seq在腫瘤組織的1089個(gè)基因中鑒定出4071個(gè)peaks，對(duì)前1000名最重要的peaks值進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在顯著peaks值中至少有兩個(gè)motif代表正常組織和腫瘤組織中最常見(jiàn)的consensus。此外研究發(fā)現(xiàn)在正常和腫瘤組織中，m6A-IP在終止密碼子和CDS周圍高度富集，正常組織中CDS(38%)和終止密碼子(26.2%)附近的m6A peaks較多，其次是3’ UTR(19.4%)和起始密碼子(11.2%)。腫瘤中m6A peaks分布在CDS(36.7%)和終止密碼子(29.5%)附近，其次是3’UTR(19.4%)和起始密碼子(11.2%)。
（6）m6A peaks與正常組織和腫瘤組織中差異表達(dá)基因mRNA的關(guān)系
正常組上調(diào)表達(dá)基因1440個(gè)，腫瘤組上調(diào)表達(dá)基因2868個(gè)。對(duì)上調(diào)基因中m6A peaks的位置進(jìn)行評(píng)估發(fā)現(xiàn)大量的m6A peaks位于相應(yīng)基因的5’端。將含有m6A的基因分為PeakStart和PeakStop組，并檢查基因表達(dá)與m6A peaks值的位置關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PeakStart和PeakStop類基因整體表達(dá)水平較高，且與腫瘤中的m6A peaks有良好的相關(guān)性。
由于HB是Wnt/β-catenin驅(qū)動(dòng)的惡性腫瘤，假設(shè)上調(diào)的m6A甲基化可能通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)CTNNB1、CCND1和NKD1等參與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的基因，在腫瘤組織中m6A豐度顯著增加。這些結(jié)果表明m6A在HB轉(zhuǎn)錄本中具有與基因表達(dá)呈正相關(guān)的傾向，并且激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路。
（7）m6A甲基化調(diào)節(jié)CTNNB1的激活
CTNNB1是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵組成部分，幾乎50 - 90%的HB都存在CTNNB1突變。研究人員首先證實(shí)了CTNNB1在HB腫瘤組織中的上調(diào)，敲低CTNNB1會(huì)顯著降低HB細(xì)胞的活性并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外還發(fā)現(xiàn)CTNNB1與METTL3的表達(dá)水平顯著正相關(guān)。通過(guò)敲除METTL3細(xì)胞來(lái)評(píng)估CTNNB1表達(dá)的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，降低m6A甲基化可以降低CTNNB1的穩(wěn)定性。綜上所述，CTNNB1可能是HB中METTL3的下游靶點(diǎn)。
關(guān)鍵圖形
Figure5 m6A甲基化與CTNNB1的表達(dá)和穩(wěn)定性呈顯著正相關(guān)
結(jié)論：
該研究在建立肝母細(xì)胞瘤RNA m6A修飾研究平臺(tái)及技術(shù)體系基礎(chǔ)上，首次發(fā)現(xiàn)RNA m6A甲基化修飾在肝母細(xì)胞瘤中異�；钴S，且篩選出甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3與肝母細(xì)胞瘤預(yù)后相關(guān)，有望成為新的預(yù)后生物標(biāo)志物；還發(fā)現(xiàn)經(jīng)典通路Wnt/β-catenin中的CTNNB1發(fā)生m6A的異常修飾，并詳細(xì)闡述了CTNNB1 m6A甲基化修飾的作用機(jī)制，該發(fā)現(xiàn)是在原有認(rèn)知的肝母細(xì)胞瘤致病機(jī)制基礎(chǔ)上開(kāi)闊了一個(gè)嶄新的研究視野。
參考文獻(xiàn)：
Liu L, Wang J, Sun G, Wu Q, Ma J, Zhang X, Huang N, Bian Z, Gu S, Xu M, Yin M, Sun F, Pan Q. m6A mRNA methylation regulates CTNNB1 to promote the proliferation of hepatoblastoma. Mol Cancer. 2019 Dec 23;18(1):188.
標(biāo)題：m6A mRNA methylation regulates CTNNB1 to promote the proliferation of hepatoblastoma（m6A甲基化修飾調(diào)控CTNNB1促進(jìn)肝母細(xì)胞瘤增殖）
時(shí)間：2019.12.23
期刊：Molecular Cancer
影響因子：IF 41.444
技術(shù)平臺(tái)：MeRIP-seq、RNA-seq、RT-PCR、Western Blot等
項(xiàng)目設(shè)計(jì)
（1）樣本選取：
HB標(biāo)本和細(xì)胞系使用了來(lái)自25例患者的原發(fā)性HB腫瘤組織及其非腫瘤對(duì)應(yīng)物（鄰近正常組織）。
（2）項(xiàng)目設(shè)計(jì)流程圖：
研究目的
m6A修飾對(duì)mRNA的穩(wěn)定性、剪接和翻譯的調(diào)控具有重要意義。然而，它在癌癥中的作用尚未被詳細(xì)研究，為進(jìn)一步研究m6A修飾在肝母細(xì)胞瘤(HB)中的生物學(xué)作用和潛在機(jī)制，本研究評(píng)估了肝母細(xì)胞瘤(HB)組織中m6A的水平，及其關(guān)鍵催化基因和整體m6A轉(zhuǎn)錄組水平概況。研究結(jié)果表明METTL3是參與異常m6A修飾的主要因素。此外還分析靶基因CTNNB1，探討了甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3在HB中參與調(diào)控CTNNB1的機(jī)制。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
（1）m6A修飾在HB中的潛在作用
研究檢測(cè)了腫瘤和正常組織中的m6A水平，并在腫瘤組織和HB細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了m6A mRNA水平的升高。此外通過(guò)RT-qPCR和Western blotting評(píng)估了m6A writers、erasers 和 readers在腫瘤和鄰近正常肝組織中的表達(dá)。與鄰近正常組織相比，大多數(shù)腫瘤的METTL3、WTAP、FTO和YTHDF2水平顯著上調(diào)。這些結(jié)果證實(shí)了m6A修飾在腫瘤組織中是上調(diào)的。
（2）METTL3、WTAP、FTO、YTHDF2在HB中的功能作用
METTL3、WTAP、FTO、YTHDF2基因的敲除顯著抑制了HB細(xì)胞的增殖，并抑制了其集落形成能力。annexin V-PI雙染檢測(cè)結(jié)果顯示，METTL3、WTAP、FTO、YTHDF2表達(dá)下調(diào)會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡�？紤]到這些基因的催化功能以及m6A修飾的上調(diào)水平，最終選擇METTL3作為候選分子作為HB中m6A異常修飾的標(biāo)記。它與m6A水平呈正相關(guān)，可能是促進(jìn)HB增殖的致癌基因以及m6A甲基轉(zhuǎn)移酶的重要活性成分。
（3）METTL3可能是HB患者診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物
對(duì)25對(duì)HB患者樣本進(jìn)行免疫組化分析。根據(jù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和Pearson s X2檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)HB中METTL3水平升高，這表明在mRNA和蛋白水平上與之前的觀察結(jié)果一致。采用RT-qPCR方法檢測(cè)組織標(biāo)本中METTL3的表達(dá)，根據(jù)中位δ ct值分為高、低組，Kaplan Meier分析顯示，METTL3表達(dá)增加的患者復(fù)發(fā)頻繁，生存期較差。ROC曲線進(jìn)一步證實(shí)了METTL3的診斷價(jià)值，這些結(jié)果表明METTL3可能是HB患者診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。
（4）METTL3促進(jìn)體內(nèi)HB腫瘤生長(zhǎng)
研究人員通過(guò)裸鼠皮下植入實(shí)驗(yàn)分析METTL3敲除對(duì)HB致瘤性的影響。用慢病毒感染Huh6細(xì)胞，表達(dá)針對(duì)METTL3的shRNA (shMETTL3-1)及其陰性對(duì)照(shNC)。RT-qPCR分析證實(shí)，與陰性對(duì)照相比，shMETTL3-1感染Huh6細(xì)胞中METTL3的表達(dá)顯著下調(diào)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中觀察到相對(duì)于非靶shRNA對(duì)照，穩(wěn)定敲除METTL3可以導(dǎo)致腫瘤體積和重量顯著減少。此外研究還證實(shí)了在METTL3敲除HB細(xì)胞Huh6和小鼠腫瘤組織中，CTNNB1下游轉(zhuǎn)錄因子TCF4和靶基因Cyclin D1的表達(dá)降低。這些實(shí)驗(yàn)支持了METTL3在HB腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的致癌作用。
（5）HB中廣泛的m6A修飾及其拓?fù)淠Ｊ?/strong>
對(duì)5個(gè)腫瘤組織和正常組織進(jìn)行m6A-seq分析，發(fā)現(xiàn)五個(gè)腫瘤組均表現(xiàn)出高水平的總m6A。m6A-seq在腫瘤組織的1089個(gè)基因中鑒定出4071個(gè)peaks，對(duì)前1000名最重要的peaks值進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在顯著peaks值中至少有兩個(gè)motif代表正常組織和腫瘤組織中最常見(jiàn)的consensus。此外研究發(fā)現(xiàn)在正常和腫瘤組織中，m6A-IP在終止密碼子和CDS周圍高度富集，正常組織中CDS(38%)和終止密碼子(26.2%)附近的m6A peaks較多，其次是3’ UTR(19.4%)和起始密碼子(11.2%)。腫瘤中m6A peaks分布在CDS(36.7%)和終止密碼子(29.5%)附近，其次是3’UTR(19.4%)和起始密碼子(11.2%)。
（6）m6A peaks與正常組織和腫瘤組織中差異表達(dá)基因mRNA的關(guān)系
正常組上調(diào)表達(dá)基因1440個(gè)，腫瘤組上調(diào)表達(dá)基因2868個(gè)。對(duì)上調(diào)基因中m6A peaks的位置進(jìn)行評(píng)估發(fā)現(xiàn)大量的m6A peaks位于相應(yīng)基因的5’端。將含有m6A的基因分為PeakStart和PeakStop組，并檢查基因表達(dá)與m6A peaks值的位置關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PeakStart和PeakStop類基因整體表達(dá)水平較高，且與腫瘤中的m6A peaks有良好的相關(guān)性。
由于HB是Wnt/β-catenin驅(qū)動(dòng)的惡性腫瘤，假設(shè)上調(diào)的m6A甲基化可能通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)CTNNB1、CCND1和NKD1等參與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的基因，在腫瘤組織中m6A豐度顯著增加。這些結(jié)果表明m6A在HB轉(zhuǎn)錄本中具有與基因表達(dá)呈正相關(guān)的傾向，并且激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路。
（7）m6A甲基化調(diào)節(jié)CTNNB1的激活
CTNNB1是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵組成部分，幾乎50 - 90%的HB都存在CTNNB1突變。研究人員首先證實(shí)了CTNNB1在HB腫瘤組織中的上調(diào)，敲低CTNNB1會(huì)顯著降低HB細(xì)胞的活性并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外還發(fā)現(xiàn)CTNNB1與METTL3的表達(dá)水平顯著正相關(guān)。通過(guò)敲除METTL3細(xì)胞來(lái)評(píng)估CTNNB1表達(dá)的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，降低m6A甲基化可以降低CTNNB1的穩(wěn)定性。綜上所述，CTNNB1可能是HB中METTL3的下游靶點(diǎn)。
關(guān)鍵圖形
Figure4 HB的m6A- seq分析
結(jié)論：
該研究在建立肝母細(xì)胞瘤RNA m6A修飾研究平臺(tái)及技術(shù)體系基礎(chǔ)上，首次發(fā)現(xiàn)RNA m6A甲基化修飾在肝母細(xì)胞瘤中異�；钴S，且篩選出甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3與肝母細(xì)胞瘤預(yù)后相關(guān)，有望成為新的預(yù)后生物標(biāo)志物；還發(fā)現(xiàn)經(jīng)典通路Wnt/β-catenin中的CTNNB1發(fā)生m6A的異常修飾，并詳細(xì)闡述了CTNNB1 m6A甲基化修飾的作用機(jī)制，該發(fā)現(xiàn)是在原有認(rèn)知的肝母細(xì)胞瘤致病機(jī)制基礎(chǔ)上開(kāi)闊了一個(gè)嶄新的研究視野。
參考文獻(xiàn)：
Liu L, Wang J, Sun G, Wu Q, Ma J, Zhang X, Huang N, Bian Z, Gu S, Xu M, Yin M, Sun F, Pan Q. m6A mRNA methylation regulates CTNNB1 to promote the proliferation of hepatoblastoma. Mol Cancer. 2019 Dec 23;18(1):188.
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