2022年3月9日，Genome Biology在線發(fā)表了華中農(nóng)業(yè)大學(xué)李青課題組團(tuán)隊(duì)題為“DNA demethylation affects imprinted gene expression in maize endosperm”的研究論文。該研究利用全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）與對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析揭示了DNA去甲基化酶影響籽粒發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的生物學(xué)功能及相關(guān)機(jī)制，為玉米籽粒產(chǎn)量的遺傳改良提供了重要理論支撐。


標(biāo)題：DNA demethylation affects imprinted gene expression in maize endosperm
期刊：Genome Biology
影響因子：IF 13.583
發(fā)表時間：2022.03.09
技術(shù)平臺：WGBS、RNA-seq、DAP-seq、qRT-PCR、表型和印記分析
 
背景：
DNA去甲基化發(fā)生在許多物種中，并涉及多種生物過程。然而玉米中DNA去甲基化的發(fā)生和作用仍然未知。玉米籽粒主要由胚和胚乳組成，基因表達(dá)在籽粒發(fā)育過程中起著重要的作用。印記現(xiàn)象是玉米胚乳中的一種特異表達(dá)模式，即來自雙親的等位基因在胚乳中只有一方表達(dá)，只有母本等位基因表達(dá)的稱為MEG（Maternally Expressed Genes），只有父本等位基因表達(dá)的稱為PEG（Paternally Expressed Genes）。然而，調(diào)控玉米籽粒胚乳印記基因表達(dá)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制尚不清楚。
 
方法：
作者對玉米中兩個調(diào)控表觀修飾的關(guān)鍵基因（ZmROS1a和ZmROS1b，均屬于B73遺傳）進(jìn)行詳細(xì)的研究。從野生型（WT）、ZmROS1a突變體、ZmROS1b突變體、ZmROS1a和ZmROS1b雜交的雙突變體（ZmROS1ab）、WT（或雙突變體）和自交系Mo17的F1雜交品系中收集自花授粉14天后的胚和胚乳。樣品立即在液氮中冷凍，并儲存在-80°C中，隨后進(jìn)行WGBS、RNA-seq、表型和印跡分析等。
 
結(jié)果：
作者分析了編碼DNA去甲基化酶的兩個關(guān)鍵基因（ZmROS1a和ZmROS1b）功能缺失突變體。結(jié)果顯示在突變體中未檢測到DNA甲基化顯著變化，但在基因和一些轉(zhuǎn)座子周圍的突變體中檢測到DNA甲基化水平增加。DNA甲基化水平的增加伴隨著基因表達(dá)下調(diào)改變，特別是在胚乳中表達(dá)的基因中。母本印記基因表達(dá)和父本基因印記表達(dá)在F1雜交品系中都發(fā)生了變化（突變體為雌性親本、野生型為雄性親本），但在互惠雜交中沒有變化。此外，基因表達(dá)改變伴隨著等位基因特異性DNA甲基化水平差異，表明DNA甲基化的變異直接調(diào)控玉米胚乳印記基因的表達(dá)。最后，作者證明雙突變體中的高甲基化與轉(zhuǎn)錄因子靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)的減少和基因表達(dá)的改變相關(guān)。
 
（1）ZmROS1a突變體、ZmROS1b突變體、雙突變體ZmROS1ab的表征


圖1 ：WT和突變體的DNA甲基化水平比較

1. ZmROS1a和ZmROS1b的基因結(jié)構(gòu)
2. 突變體和WT的全基因組DNA 甲基化水平
3. CG、CHG 和 CHH 位點(diǎn)（上）和 TE（下）周圍的 DNA 甲基化水平

（2）ZmROS1ab雙突變體的全基因組DNA甲基化模式
圖2：ZmROS1ab 雙突變體DMR表征

1. 胚和胚乳中WT和ZmROS1ab突變體的DMR。
2. 在WT 中胚胎和胚乳的 DMR。
3. a的DMR 與b的 DMR 重疊。
4. c圖的DMR重疊DNA 甲基化水平熱圖。
5. “ ZmROS1ab敏感” DMR的基因組特征。

 

（3）ZmROS1ab 調(diào)控胚乳基因表達(dá)
圖3：ZmROS1ab調(diào)控胚乳基因表達(dá)。

1. ZmROS1ab敏感基因更有可能在胚乳中表現(xiàn)出差異表達(dá)。
2. 大部分ZmROS1ab敏感DEG顯示下調(diào)（P<0.001）。
3. ZmROS1ab敏感DEG的組織表達(dá)模式。
4. 在胚乳中表達(dá)的ZmROS1ab敏感基因更有可能表現(xiàn)出差異表達(dá)。
5. 在胚乳中表達(dá)的ZmROS1ab敏感DEG更可能表現(xiàn)出下調(diào)。
6. 跨組織和ZmROS1ab突變體的ZmROS1ab敏感 DEG的 DNA 甲基化譜。
7. 三種情況下的DNA甲基化水平和在胚乳中特異性基因的表達(dá)水平。
8. WT和ZmROS1ab突變體所有表達(dá)基因和胚乳特異性基因的表達(dá)水平熱圖。
9. WT和Zmros1ab的差異倍數(shù)變化分布。

（4）ZmROS1ab與胚乳印跡基因表達(dá)

圖4：作為母本基因遺傳時，ZmROS1ab調(diào)控胚乳印記表達(dá)

1. 胚乳印記基因的鑒定。
2. bM和BM F1雜交品系差異表達(dá)的MEG和PEG表達(dá)水平。
3. MEG和PEG的組織表達(dá)模式。
4. BM和bM雜交中母本reads比較

（5）印跡基因表達(dá)變化與 DNA 甲基化水平變化
圖5：胚乳印記基因表達(dá)與DNA甲基化有關(guān)
a和b. 兩個等位基因在野生型BM雜交或MEG（a）和PEG（b）突變型bM雜交中的表達(dá)。RT-PCR（右圖）和RNA-seq（左圖中的條形圖）結(jié)果。
c和d. 重亞硫酸鹽PCR檢測a（c）的MEG和b（d）的PEG甲基化水平
 

（6）ZmROS1ab突變體DNA 甲基化水平與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)

圖6：ZmROS1ab誘導(dǎo)的DNA去甲基化影響轉(zhuǎn)錄因子（TF）結(jié)合。

1. WT和ZmROS1ab突變體發(fā)現(xiàn)ZmO2結(jié)合peaks重疊。
2. 鑒定WT和Zmros1ab突變體的差異peaks。
3. 比較差異peaks和非差異peaks的DNA甲基化水平。（P<0.001,ns不顯著）
4. IGV視圖顯示W(wǎng)T和突變體ZmO2的差異結(jié)合。

結(jié)論：
以上研究結(jié)果證明DNA甲基化的變異直接調(diào)控玉米胚乳印記基因的表達(dá)，揭示了DNA去甲基化酶影響籽粒發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的生物學(xué)功能及相關(guān)機(jī)制，為玉米籽粒產(chǎn)量的遺傳改良提供了重要理論支撐。


 
關(guān)于植物DNA甲基化研究
（1）植物中的DNA甲基化
對于植物而言，面對生長環(huán)境的改變，表觀遺傳的變異會改變植物DNA的構(gòu)象，從而改變?nèi)旧�質(zhì)和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，達(dá)到調(diào)節(jié)基因組的作用。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)植物面臨生物脅迫和非生物脅迫時，植物基因組中DNA甲基化會發(fā)生改變，并且這些改變會遺傳給后代。所以DNA甲基化的改變能夠豐富植物物種的多樣性，加強(qiáng)植物的環(huán)境適應(yīng)性。
不同于哺乳動物基因組只有CG甲基化，植物基因組甲基化有CG，CHG，CHH（H代表任何非G的堿基）甲基化。而維持這三種不同的DNA甲基化的分子機(jī)制非常復(fù)雜。



（2）植物中的DNA甲基化研究技術(shù)



（3）植物DNA甲基化研究思路
植物DNA甲基化一般遵循三個步驟進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘。首先，進(jìn)行整體全基因組甲基化變化的分析，包括平均甲基化水平變化、甲基化水平分布變化、降維分析、聚類分析、相關(guān)性分析等。其次，進(jìn)行甲基化差異水平分析，篩選具體差異基因，包括DMC/DMR/DMG鑒定、DMC/DMR在基因組元件上的分布、DMC/DMR的TF結(jié)合分析、時序甲基化數(shù)據(jù)的分析策略、DMG的功能分析等。最后，將甲基化組學(xué)&轉(zhuǎn)錄組學(xué)關(guān)聯(lián)分析，包括Meta genes整體關(guān)聯(lián)、DMG-DEG對應(yīng)關(guān)聯(lián)、網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)等。


參考文獻(xiàn)：https://doi.org/10.1186/s13059-022-02641-x