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微生物組測(cè)序應(yīng)用:早產(chǎn)兒出生后不同時(shí)間點(diǎn)腸道微生物定植的動(dòng)態(tài)變化
2023年02月17日，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所Adnan Khan、云南省第一人民醫(yī)院米弘瑛為共同第一作者，中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院郝虎/李思濤、南方醫(yī)科大學(xué)附屬佛山市婦幼保健院戴怡蘅為論文共同通訊作者在《Front Microbiol》雜志以“Dynamic changes of the gut microbial colonization in preterm infants with different time points after birth”為題發(fā)表研究論文。該研究通過(guò)微生物組學(xué)的16s RNA等實(shí)驗(yàn)揭示了12名早產(chǎn)兒在出生后第1、7、14、21、28、42天六個(gè)時(shí)間點(diǎn)（C1、C2、C3、C4、C5、C6）腸道微生物定植過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，為早產(chǎn)兒在出生后不同時(shí)間點(diǎn)針對(duì)性細(xì)菌治療提供新的視角。深圳易基因科技為本研究提供微生物組測(cè)序分析服務(wù)。
標(biāo)題：Dynamic changes of the gut microbial colonization in preterm infants with different time points after birth 早產(chǎn)兒出生后不同時(shí)間點(diǎn)腸道微生物定植的動(dòng)態(tài)變化
時(shí)間：2023-02-17
期刊：Frontiers in Microbiology
影響因子：IF 6.064
技術(shù)平臺(tái)：16S rRNA等
摘要：
與早產(chǎn)相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)在所有妊娠中分布不均衡。在孕早期，壞死性小腸結(jié)腸炎（NEC）和晚發(fā)性敗血癥（LOS）等并發(fā)癥更為常見(jiàn)，且與腸道微生物組組成變化相關(guān)。常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)表明，早產(chǎn)兒腸道微生物組的定殖與健康足月兒的腸道微生物組定殖有顯著差異。本研究旨在分析早產(chǎn)兒在不同時(shí)間點(diǎn)（出生后第1、7、14、21、28、42 天）糞便微生物組的動(dòng)態(tài)變化。研究招募了2017年1月至2017年12月在中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院住院的12名早產(chǎn)兒，利用16S rRNA基因測(cè)序分析對(duì)130份早產(chǎn)兒糞便樣本進(jìn)行分析。研究結(jié)果表明早產(chǎn)兒糞便微生物群的定植過(guò)程在出生后的不同時(shí)間點(diǎn)呈高度動(dòng)態(tài)變化，即Exiguobacterium、Acinetobacter和Citrobacter隨著年齡增長(zhǎng)表現(xiàn)出豐度下降模式，而在42天的早產(chǎn)兒糞便微生物群發(fā)育過(guò)程中，腸球菌（克雷伯氏菌和大腸桿菌）菌群逐漸生長(zhǎng)成為主要微生物群。而早產(chǎn)兒腸道雙歧桿菌的定植相對(duì)較晚，并沒(méi)有迅速成為主要的微生物群。此外，研究結(jié)果還表明Chryseobacterium菌群的存在，且在不同時(shí)間點(diǎn)的定殖不同。本研究為早產(chǎn)兒出生后不同時(shí)間點(diǎn)針對(duì)性細(xì)菌治療提供新的視角。
材料和方法：
表1：12例早產(chǎn)兒的一般臨床數(shù)據(jù)
圖1：研究流程圖
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
（1）早產(chǎn)兒微生物群落組成的綜合表征
研究人員使用來(lái)自12名早產(chǎn)兒出生后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)（C1-C6）的130份糞便樣品的16S rRNA基因數(shù)據(jù)來(lái)評(píng)估微生物多樣性的時(shí)間相關(guān)變化，鑒定不同時(shí)間點(diǎn)微生物組中的最大豐度和富集驅(qū)動(dòng)因子，并分析糞便微生物在早產(chǎn)兒健康發(fā)育過(guò)程中的表型和功能。
圖2：早產(chǎn)兒6個(gè)時(shí)間點(diǎn)腸道微生物類(lèi)群相對(duì)豐度的比較。
（2）早產(chǎn)兒出生后不同時(shí)間點(diǎn)腸道菌群中豐度最高的屬（genera）
對(duì)豐度最高的屬分析與β多樣性分析結(jié)果一致，表明豐度最高的屬多樣性隨時(shí)間推移而增加。結(jié)果表明豐度最高的屬（Exiguobacterium、Prevotella、Acinetobacter、Pseudomonas、Enterococcus、Bifidobacterium、Escherichia-Shigella、Klebsiella、Gardnerella、Streptococcus和Chryseobacterium）發(fā)生了時(shí)間依賴(lài)性變化，且在各組區(qū)系結(jié)構(gòu)中的樣本異質(zhì)性增加。圖3A顯示了不同時(shí)間點(diǎn)組中前40個(gè)豐度最高的屬，其中一半為所有時(shí)間點(diǎn)組間共有（圖3B）。圖3C中的熱圖通過(guò)聚類(lèi)分析表明，C1-C3中的糞便微生物群由Exiguobacterium、Pseudomonas、Lactococcus、Brevundimonas、Burkholderiaceae和Thermus組成；C3-C5中為Enterococcus富集區(qū)，在C6中為Escherichia−Shigella富集區(qū)。
圖3：豐度最高的腸道微生物屬在早產(chǎn)兒6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)組中富集情況。
（3）早產(chǎn)兒6個(gè)時(shí)間點(diǎn)腸道微生物組的差異分類(lèi)
為進(jìn)一步表征六個(gè)時(shí)間點(diǎn)組間腸道微生物群的動(dòng)態(tài)變化，本研究在不同的分類(lèi)水平上對(duì)這些分類(lèi)群的系統(tǒng)發(fā)育變化進(jìn)行時(shí)間點(diǎn)依賴(lài)性分布分析，即：屬、門(mén)、綱、目、科、種。
圖4：在早產(chǎn)兒的六個(gè)時(shí)間點(diǎn)組中富集的顯著差異分類(lèi)群。
A-F. 早產(chǎn)兒不同時(shí)間點(diǎn)腸道優(yōu)勢(shì)微生物屬（genus）水平的動(dòng)態(tài)變化。
（4）早產(chǎn)兒年齡依賴(lài)性腸道微生物群網(wǎng)絡(luò)及其關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)屬
研究人員利用稀疏成分相關(guān)性（SparCC）分析來(lái)研究所有時(shí)間依賴(lài)性樣品中腸道微生物之間的相互作用。所有相對(duì)豐度≥0.1%的屬都包含在網(wǎng)絡(luò)中。Exiguobacterium（Firmicutes）網(wǎng)絡(luò)與不動(dòng)桿菌（Proteobacteria）、假單胞菌（Proteobacteria）和乳球菌（Firmicutes）的相關(guān)性最強(qiáng)。同樣，Serratia（Proteobacteria）也與Veillonella（Firmicutes）呈現(xiàn)出強(qiáng)相關(guān)性。但Streptococcus、Staphylococcus、Enterococcus、Bacillus (Firmicutes)與其他屬的相關(guān)性最弱。前12個(gè)顯著差異屬的熱圖和層次聚類(lèi)分析表明了樣本的相關(guān)性（|FC|>1、p<0.05）。
圖5：早產(chǎn)兒年齡依賴(lài)性腸道微生物群網(wǎng)絡(luò)及其關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)屬
（5）基于分類(lèi)組成預(yù)測(cè)微生物代謝功能
為更好了解早產(chǎn)兒腸道微生物組、疾病易感性和細(xì)菌代謝的功能差異，研究人員利用PICRUSt通過(guò)分析生成的OUT及其參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的16S rRNA數(shù)據(jù)中的基因，來(lái)預(yù)測(cè)細(xì)菌宏基因組的基因家族。結(jié)果表明，在早產(chǎn)兒C1、C2、C3、C5和C6組中，分別有63個(gè)、1個(gè)、5個(gè)、22個(gè)和24個(gè)KEGG通路顯著過(guò)表達(dá)。C1、C2、C3和C5組中鑒定的大多數(shù)通路為維持生命所必需，包括ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、核苷酸代謝、抗壞血酸、醛酸鹽代謝、碳水化合物、蛋白質(zhì)代謝二惡英降解和脂質(zhì)代謝。描述代謝過(guò)程和免疫狀態(tài)的許多通路在所有組中均過(guò)度表達(dá)（over-represented，即富集enriched）。所有這些通路對(duì)于影響微生物在環(huán)境中的分布、存活和增殖至關(guān)重要，結(jié)果還需要使用宏基因組學(xué)來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。
圖6：早產(chǎn)兒出生后6個(gè)時(shí)間點(diǎn)（C1、C2、C3、C5、C6）的組間功能模塊相對(duì)豐度比較，使用從PICRUSt生成的線性判別分析效應(yīng)量（LEfSe）分析。35個(gè)、1個(gè)、5個(gè)、18個(gè)和15個(gè)KEGG通路分別在C1、C2、C3、C4和C6中顯著富集。數(shù)據(jù)顯示，所有組間預(yù)測(cè)的細(xì)菌代謝功能存在差異。LDA評(píng)分>2.5表示具有顯著差異的通路。
結(jié)論：
本研究結(jié)果將有助于更好地了解早產(chǎn)兒出生后腸道微生物群變化對(duì)健康的長(zhǎng)期影響，本研究首次對(duì)出生42日齡以內(nèi)的早產(chǎn)兒糞便微生物組組成進(jìn)行研究。結(jié)果表明早產(chǎn)兒糞便微生物群在出生后一天左右較為簡(jiǎn)單，Exiguobacterium、Acinetobacter和Citrobacter占整個(gè)微生物群的83%。隨著時(shí)間的推移，這三個(gè)主要細(xì)菌家族的相對(duì)豐度下降，而Enterococcus、Klebsiella、Escherichia菌群逐漸增加，并成為主要菌群，其中任何一種細(xì)菌都可能引起消化道感染。同時(shí)，早產(chǎn)兒腸道雙歧桿菌的定植相對(duì)較晚，并沒(méi)有迅速成為主要的微生物群。而新生兒重癥監(jiān)護(hù)室早產(chǎn)兒的糞便微生物群中存在Chrysobacterium菌群，表明其健康存在額外風(fēng)險(xiǎn)。本研究旨在為比較和理解早產(chǎn)兒腸道微生物群的時(shí)間依賴(lài)性動(dòng)態(tài)變化開(kāi)辟新的可能性，
并為早產(chǎn)兒在出生后不同時(shí)間點(diǎn)針對(duì)性細(xì)菌治療提供新的視角。
參考文獻(xiàn)：https://www.pmop.cn/pubmed/36876108
標(biāo)題：Dynamic changes of the gut microbial colonization in preterm infants with different time points after birth 早產(chǎn)兒出生后不同時(shí)間點(diǎn)腸道微生物定植的動(dòng)態(tài)變化
時(shí)間：2023-02-17
期刊：Frontiers in Microbiology
影響因子：IF 6.064
技術(shù)平臺(tái)：16S rRNA等
摘要：
與早產(chǎn)相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)在所有妊娠中分布不均衡。在孕早期，壞死性小腸結(jié)腸炎（NEC）和晚發(fā)性敗血癥（LOS）等并發(fā)癥更為常見(jiàn)，且與腸道微生物組組成變化相關(guān)。常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)表明，早產(chǎn)兒腸道微生物組的定殖與健康足月兒的腸道微生物組定殖有顯著差異。本研究旨在分析早產(chǎn)兒在不同時(shí)間點(diǎn)（出生后第1、7、14、21、28、42 天）糞便微生物組的動(dòng)態(tài)變化。研究招募了2017年1月至2017年12月在中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院住院的12名早產(chǎn)兒，利用16S rRNA基因測(cè)序分析對(duì)130份早產(chǎn)兒糞便樣本進(jìn)行分析。研究結(jié)果表明早產(chǎn)兒糞便微生物群的定植過(guò)程在出生后的不同時(shí)間點(diǎn)呈高度動(dòng)態(tài)變化，即Exiguobacterium、Acinetobacter和Citrobacter隨著年齡增長(zhǎng)表現(xiàn)出豐度下降模式，而在42天的早產(chǎn)兒糞便微生物群發(fā)育過(guò)程中，腸球菌（克雷伯氏菌和大腸桿菌）菌群逐漸生長(zhǎng)成為主要微生物群。而早產(chǎn)兒腸道雙歧桿菌的定植相對(duì)較晚，并沒(méi)有迅速成為主要的微生物群。此外，研究結(jié)果還表明Chryseobacterium菌群的存在，且在不同時(shí)間點(diǎn)的定殖不同。本研究為早產(chǎn)兒出生后不同時(shí)間點(diǎn)針對(duì)性細(xì)菌治療提供新的視角。
材料和方法：
表1：12例早產(chǎn)兒的一般臨床數(shù)據(jù)圖1：研究流程圖
- 選擇實(shí)驗(yàn)組以鑒定組間微生物群的差異
- 標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)因素和樣品處理，以控制過(guò)程的每個(gè)步驟引入的變化。從臨床變量到樣本處理，收集和管理每個(gè)樣本各個(gè)方面的metadata做數(shù)據(jù)分析。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
（1）早產(chǎn)兒微生物群落組成的綜合表征
研究人員使用來(lái)自12名早產(chǎn)兒出生后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)（C1-C6）的130份糞便樣品的16S rRNA基因數(shù)據(jù)來(lái)評(píng)估微生物多樣性的時(shí)間相關(guān)變化，鑒定不同時(shí)間點(diǎn)微生物組中的最大豐度和富集驅(qū)動(dòng)因子，并分析糞便微生物在早產(chǎn)兒健康發(fā)育過(guò)程中的表型和功能。
圖2：早產(chǎn)兒6個(gè)時(shí)間點(diǎn)腸道微生物類(lèi)群相對(duì)豐度的比較。
- 從門(mén)（Phyla）水平上分析6個(gè)時(shí)間點(diǎn)腸道微生物群的組成。
- 組間（C1–C6）的F/P比值箱形圖。
- 六個(gè)時(shí)間點(diǎn)組間腸道微生物門(mén)（Phyla）的重疊分析Venn圖。包括在六個(gè)以上的糞便樣本中檢測(cè)到的門(mén)。
- 使用Shannon指數(shù)分析六組細(xì)菌群落的α多樣性和豐度。
- 使用Bray–Curtis差異的NMDS進(jìn)行Beta（β）多樣性分析。
- 不同時(shí)間點(diǎn)組間腸道微生物群的未加權(quán)Unifrac距離（Unweighted Unifrac distance）。使用非參數(shù)Kruskal–Wallis檢驗(yàn)和Tukey檢驗(yàn)計(jì)算成對(duì)p值：*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001為具有顯著性。
（2）早產(chǎn)兒出生后不同時(shí)間點(diǎn)腸道菌群中豐度最高的屬（genera）
對(duì)豐度最高的屬分析與β多樣性分析結(jié)果一致，表明豐度最高的屬多樣性隨時(shí)間推移而增加。結(jié)果表明豐度最高的屬（Exiguobacterium、Prevotella、Acinetobacter、Pseudomonas、Enterococcus、Bifidobacterium、Escherichia-Shigella、Klebsiella、Gardnerella、Streptococcus和Chryseobacterium）發(fā)生了時(shí)間依賴(lài)性變化，且在各組區(qū)系結(jié)構(gòu)中的樣本異質(zhì)性增加。圖3A顯示了不同時(shí)間點(diǎn)組中前40個(gè)豐度最高的屬，其中一半為所有時(shí)間點(diǎn)組間共有（圖3B）。圖3C中的熱圖通過(guò)聚類(lèi)分析表明，C1-C3中的糞便微生物群由Exiguobacterium、Pseudomonas、Lactococcus、Brevundimonas、Burkholderiaceae和Thermus組成；C3-C5中為Enterococcus富集區(qū)，在C6中為Escherichia−Shigella富集區(qū)。
圖3：豐度最高的腸道微生物屬在早產(chǎn)兒6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)組中富集情況。
- 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)（C1-C6）內(nèi)豐度最高的前40個(gè)屬
- 6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)組間腸道微生物屬的重疊分析Venn圖。
- 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)組間腸道微生物群中差異表達(dá)最顯著的屬。名稱(chēng)前面的單個(gè)字母（g、f和c）分別表示屬、門(mén)和綱。
（3）早產(chǎn)兒6個(gè)時(shí)間點(diǎn)腸道微生物組的差異分類(lèi)
為進(jìn)一步表征六個(gè)時(shí)間點(diǎn)組間腸道微生物群的動(dòng)態(tài)變化，本研究在不同的分類(lèi)水平上對(duì)這些分類(lèi)群的系統(tǒng)發(fā)育變化進(jìn)行時(shí)間點(diǎn)依賴(lài)性分布分析，即：屬、門(mén)、綱、目、科、種。
圖4：在早產(chǎn)兒的六個(gè)時(shí)間點(diǎn)組中富集的顯著差異分類(lèi)群。
A-F. 早產(chǎn)兒不同時(shí)間點(diǎn)腸道優(yōu)勢(shì)微生物屬（genus）水平的動(dòng)態(tài)變化。
- 從門(mén)到屬水平的顯著差異分類(lèi)群系統(tǒng)發(fā)育分支圖。微生物類(lèi)用字母表示。每個(gè)節(jié)點(diǎn)表示不同分類(lèi)級(jí)別的一個(gè)分類(lèi)單元。節(jié)點(diǎn)顏色是在相關(guān)隊(duì)列（C1-C6）中觀察到的豐度較高的分類(lèi)群。
- 具有顯著差異的物種LDA得分大于預(yù)估值；默認(rèn)分?jǐn)?shù)為2.5。直方圖長(zhǎng)度表示LDA分?jǐn)?shù)；表示不同群體之間具有存在顯著差異的物種影響影響程度。
（4）早產(chǎn)兒年齡依賴(lài)性腸道微生物群網(wǎng)絡(luò)及其關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)屬
研究人員利用稀疏成分相關(guān)性（SparCC）分析來(lái)研究所有時(shí)間依賴(lài)性樣品中腸道微生物之間的相互作用。所有相對(duì)豐度≥0.1%的屬都包含在網(wǎng)絡(luò)中。Exiguobacterium（Firmicutes）網(wǎng)絡(luò)與不動(dòng)桿菌（Proteobacteria）、假單胞菌（Proteobacteria）和乳球菌（Firmicutes）的相關(guān)性最強(qiáng)。同樣，Serratia（Proteobacteria）也與Veillonella（Firmicutes）呈現(xiàn)出強(qiáng)相關(guān)性。但Streptococcus、Staphylococcus、Enterococcus、Bacillus (Firmicutes)與其他屬的相關(guān)性最弱。前12個(gè)顯著差異屬的熱圖和層次聚類(lèi)分析表明了樣本的相關(guān)性（|FC|>1、p<0.05）。
圖5：早產(chǎn)兒年齡依賴(lài)性腸道微生物群網(wǎng)絡(luò)及其關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)屬
- 根據(jù)SparCC結(jié)果構(gòu)建早產(chǎn)兒的微生物交互網(wǎng)絡(luò)，并使用Cytoscape進(jìn)行可視化。（C1）出生后第1天、（C2）出生后第7天、（C3）出生后第14 天、（C4）出生后第21天、（C5）出生后第28天、（C6）出生后第42天。網(wǎng)絡(luò)包含平均豐度>0.1%的屬、相關(guān)性|R|>0.2和p<0.05，節(jié)點(diǎn)顏色表示屬的門(mén)，節(jié)點(diǎn)大小表示加權(quán)節(jié)點(diǎn)連接，邊緣顏色和厚度表示相關(guān)性。
- 所有時(shí)間依賴(lài)性樣本（C1–C6）中前12個(gè)顯著差異的微生物屬熱圖。紅色對(duì)應(yīng)于上調(diào)的基因產(chǎn)物，綠色對(duì)應(yīng)于下調(diào)的基因產(chǎn)物。行表示每個(gè)差異表達(dá)的門(mén)，列表示每個(gè)樣本
（5）基于分類(lèi)組成預(yù)測(cè)微生物代謝功能
為更好了解早產(chǎn)兒腸道微生物組、疾病易感性和細(xì)菌代謝的功能差異，研究人員利用PICRUSt通過(guò)分析生成的OUT及其參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的16S rRNA數(shù)據(jù)中的基因，來(lái)預(yù)測(cè)細(xì)菌宏基因組的基因家族。結(jié)果表明，在早產(chǎn)兒C1、C2、C3、C5和C6組中，分別有63個(gè)、1個(gè)、5個(gè)、22個(gè)和24個(gè)KEGG通路顯著過(guò)表達(dá)。C1、C2、C3和C5組中鑒定的大多數(shù)通路為維持生命所必需，包括ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、核苷酸代謝、抗壞血酸、醛酸鹽代謝、碳水化合物、蛋白質(zhì)代謝二惡英降解和脂質(zhì)代謝。描述代謝過(guò)程和免疫狀態(tài)的許多通路在所有組中均過(guò)度表達(dá)（over-represented，即富集enriched）。所有這些通路對(duì)于影響微生物在環(huán)境中的分布、存活和增殖至關(guān)重要，結(jié)果還需要使用宏基因組學(xué)來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。
圖6：早產(chǎn)兒出生后6個(gè)時(shí)間點(diǎn)（C1、C2、C3、C5、C6）的組間功能模塊相對(duì)豐度比較，使用從PICRUSt生成的線性判別分析效應(yīng)量（LEfSe）分析。35個(gè)、1個(gè)、5個(gè)、18個(gè)和15個(gè)KEGG通路分別在C1、C2、C3、C4和C6中顯著富集。數(shù)據(jù)顯示，所有組間預(yù)測(cè)的細(xì)菌代謝功能存在差異。LDA評(píng)分>2.5表示具有顯著差異的通路。
結(jié)論：
本研究結(jié)果將有助于更好地了解早產(chǎn)兒出生后腸道微生物群變化對(duì)健康的長(zhǎng)期影響，本研究首次對(duì)出生42日齡以內(nèi)的早產(chǎn)兒糞便微生物組組成進(jìn)行研究。結(jié)果表明早產(chǎn)兒糞便微生物群在出生后一天左右較為簡(jiǎn)單，Exiguobacterium、Acinetobacter和Citrobacter占整個(gè)微生物群的83%。隨著時(shí)間的推移，這三個(gè)主要細(xì)菌家族的相對(duì)豐度下降，而Enterococcus、Klebsiella、Escherichia菌群逐漸增加，并成為主要菌群，其中任何一種細(xì)菌都可能引起消化道感染。同時(shí)，早產(chǎn)兒腸道雙歧桿菌的定植相對(duì)較晚，并沒(méi)有迅速成為主要的微生物群。而新生兒重癥監(jiān)護(hù)室早產(chǎn)兒的糞便微生物群中存在Chrysobacterium菌群，表明其健康存在額外風(fēng)險(xiǎn)。本研究旨在為比較和理解早產(chǎn)兒腸道微生物群的時(shí)間依賴(lài)性動(dòng)態(tài)變化開(kāi)辟新的可能性，
并為早產(chǎn)兒在出生后不同時(shí)間點(diǎn)針對(duì)性細(xì)菌治療提供新的視角。
參考文獻(xiàn)：https://www.pmop.cn/pubmed/36876108
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