全球有超過50,000種人類相關(guān)的遺傳疾病，其中大部分是由基因組的點突變（point mutation, PM）引起的。而對于罕見病而言，80%是由基因缺陷引起的，同時這些基因缺陷中點突變又占了60%。研究表明，點突變能使人類對癌癥、聽力疾病、精神病等多種疾病的易感性增加。

研究點突變相關(guān)遺傳疾病，免不了要構(gòu)建細(xì)胞模型。點突變細(xì)胞模型可以直接研究細(xì)胞信號傳導(dǎo)、代謝和分化等機制，是研究基因功能和調(diào)控、癌癥、遺傳疾病等生物學(xué)和醫(yī)學(xué)問題的重要工具，具有精確模擬基因變異、可控性高、安全省時等優(yōu)點。
 

點突變細(xì)胞模型的構(gòu)建

構(gòu)建細(xì)胞點突變細(xì)胞模型時的理論基礎(chǔ)是基因的同源重組修復(fù)。當(dāng)細(xì)胞基因組DNA雙鏈由于外部因素而斷裂時，細(xì)胞中存在著的DNA修復(fù)機制就會被激發(fā)，對斷裂位點的DNA雙鏈進(jìn)行修復(fù)，根據(jù)修復(fù)方式的不同可分為同源重組修復(fù)和非同源重組修復(fù)。顧名思義，同源重組是指DNA在修復(fù)的過程中以同源的DNA序列作為模板完美修復(fù)，而非同源重組修復(fù)是指細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)蛋白直接將斷裂的DNA兩端重新連起來，同時可能會隨機引入新的堿基。
 

DNA雙鏈斷裂修復(fù)途徑。（A. 同源重組修復(fù)，B. 非同源重組修復(fù)）

根據(jù)這個理論基礎(chǔ)，點突變細(xì)胞模型的構(gòu)建分為三個部分：

1.定點切割DNA
由于在自然界中DNA的斷裂是隨機的、不確定的，因此我們需要人為定點對DNA產(chǎn)生切割。在這個過程中，CRISPR-Cas9技術(shù)給我們提供了極大的便利。我們可以通過人為設(shè)計sgRNA，并將Cas9蛋白與sgRNA一起轉(zhuǎn)染到目的細(xì)胞中。在sgRNA的引導(dǎo)下，Cas9蛋白對靶位點處的DNA進(jìn)行切割，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂。

2.同源重組修復(fù)DNA
我們通過CRISPR-Cas9技術(shù)使細(xì)胞內(nèi)的基因組DNA產(chǎn)生了雙鏈斷裂后，同時引發(fā)了細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機制。因此，為了使DNA在修復(fù)過程中能通過同源重組的方式修復(fù)DNA并引入突變位點，我們需要為細(xì)胞提供額外的同源修復(fù)模板。這個模板的本質(zhì)是人為合成的DNA序列，由5’端同源臂、突變位點和3’端同源臂組成。值得注意的是，這種同源模板序列是隨sgRNA和Cas9蛋白一起轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的。

3.陽性細(xì)胞篩選
這部分是細(xì)胞模型構(gòu)建的關(guān)鍵部分。試想下，我們通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將CRISPR-Cas9系統(tǒng)和模板DNA序列轉(zhuǎn)入細(xì)胞中后，由于細(xì)胞內(nèi)部機制的作用，我們得到的細(xì)胞池中既包含純合子陽性細(xì)胞和雜合子細(xì)胞，又包含沒有發(fā)生堿基突變的野生型細(xì)胞。那么，我們該如何挑選出目的細(xì)胞呢？對于點突變模型來說，由于沒有引入抗性基因，常用的方法便是通過稀釋法將細(xì)胞池的細(xì)胞稀釋轉(zhuǎn)移到96孔板中，形成單克隆細(xì)胞，然后收集單克隆細(xì)胞進(jìn)行大量測序，以得到預(yù)期的純合子細(xì)胞。
 

點突變細(xì)胞模型推薦

由于人類疾病中基因產(chǎn)物并非總是如轉(zhuǎn)基因一樣的高表達(dá)，也不是像基因敲除一樣完全不表達(dá)，很多情況下只是因單個或者少數(shù)幾個堿基的改變而造成的蛋白結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)為非正常激活或抑制。因此，構(gòu)建精細(xì)的、與疾病對應(yīng)的點突變細(xì)胞模型便成為了疾病臨床前研究的最佳方案，而CRISPR-Cas9技術(shù)則使得我們能夠以更低的成本和更高的效率實現(xiàn)這一目標(biāo)。

經(jīng)大量測試和實驗工藝優(yōu)化，賽業(yè)生物開發(fā)了Smart-CRISPR™細(xì)胞基因編輯系統(tǒng)，實現(xiàn)更深度的基因信息分析和更合理的gRNA設(shè)計。基于該系統(tǒng)，我們能提供準(zhǔn)確快速的點突變細(xì)胞模型構(gòu)建服務(wù)，通過優(yōu)化的α-donor體系將人源化的Cas9蛋白、gRNA和donor三組分轉(zhuǎn)染至目的細(xì)胞，產(chǎn)生高效同源重組，實現(xiàn)純合子交付，快至八周。現(xiàn)在下單，HEK293T、A549、HCT 116、HEK293等多種細(xì)胞的點突變項目均可享受3.98萬的優(yōu)惠價格。
 

基因編輯細(xì)胞系實用指南

基因敲除的sgRNA要如何設(shè)計？又要如何檢測脫靶？為什么篩選出了很多單克隆雜合子，但無法篩選出純合子？對于這些問題，做基因編輯細(xì)胞系的小伙伴們應(yīng)該不會感到陌生。這本「基因編輯細(xì)胞系常見問題解答」將為你答疑解惑，掃碼免費下載領(lǐng)取電子版，距你理想的研究目標(biāo)又近了億點點！