SpectraMax Paradigm高通量藥物篩選平臺(tái)的應(yīng)用

瀏覽次數(shù)：1609　發(fā)布日期：2023-3-22　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

頂刊藥篩的選擇？發(fā)Cell和新冠藥篩都需要用到它

藥物篩選無(wú)論在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域或是藥物開發(fā)領(lǐng)域都是十分重要的環(huán)節(jié)，在這個(gè)過(guò)程中篩選得到靶向特定靶點(diǎn)的高生理活性的化合物無(wú)疑是至關(guān)重要的。

現(xiàn)如今繁多的化合物種類和日漸增加的新靶點(diǎn)，都指向了高通量藥物篩選的必要性，而無(wú)論是使用較為傳統(tǒng)的ELISA，還是通過(guò)FRET、HTRF等方法，都可以通過(guò)高通量藥物篩選平臺(tái)SpectraMax Paradigm進(jìn)行檢測(cè)，一次性完成6、24、96、384乃至1536/3456孔板的檢測(cè)，極大地提高了實(shí)驗(yàn)效率和準(zhǔn)確性，能夠更好地滿足實(shí)際實(shí)驗(yàn)中藥物篩選需要。無(wú)論是發(fā)表在Cell上，篩選靶向TLS抗腫瘤藥物的研究，還是在新冠大流行背景下，對(duì)靶向新型冠狀病毒主蛋白酶的抗病毒藥物的篩選，或者是在常規(guī)實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)H₂O₂水平的需求，都可以通過(guò)SpectraMax Paradigm這一臺(tái)儀器完成，下文將具體就相關(guān)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)、結(jié)果與具體實(shí)驗(yàn)流程展開介紹。

1. A Small Molecule Targeting Mutagenic Translesion Synthesis Improves Chemotherapy Cell 66.850

在腫瘤治療領(lǐng)域當(dāng)中，傳統(tǒng)的通過(guò)損傷DNA的方式殺傷腫瘤細(xì)胞的化學(xué)療法一直具有無(wú)法取代的地位。而在這種治療之下，細(xì)胞可以通過(guò)跨損傷合成（TLS）這個(gè)過(guò)程利用專門化的DNA聚合酶從而繞開DNA損傷的區(qū)域，以犧牲DNA保真度為代價(jià)促進(jìn)細(xì)胞存活。而此篇文章的重大意義在于通過(guò)篩選找到了這樣一種可以靶向TLS過(guò)程的小分子抑制劑JH-RE-06，可以阻止誘變POLζ的募集來(lái)破壞誘變TLS，并且通過(guò)后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得到順鉑、JH-RE-06可雙藥聯(lián)合相較于順鉑的單藥化療來(lái)說(shuō)對(duì)小鼠的耐藥腫瘤模型上顯示出更顯著的腫瘤抑制作用，并且可以降低由于化療所引起的繼發(fā)性腫瘤的可能性，從而降低傳統(tǒng)化學(xué)治療的副作用。

Figure 1 阻斷 REV1 CTD-REV7相互作用的小分子抑制劑JH-RE-06的發(fā)現(xiàn)與其特征

在化合物的篩選步驟中應(yīng)用到了ELISA實(shí)驗(yàn)。在 ELISA 實(shí)驗(yàn)(Figure 1A)中，將純化后共表達(dá)REV3肽鏈的 His₈-REV7固定在 Ni²⁺-NTA 包被的孔中，并通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)耦聯(lián)的抗FLAG抗體檢測(cè)其在小分子抑制劑存在情況下結(jié)合FLAG標(biāo)記的cREV1 CTD的能力。作者選擇TMB作為底物，反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)使用高通量藥物篩選平臺(tái)SpectraMax Paradigm檢測(cè)450nm處的吸光度來(lái)尋找可以和REV1 CTD-REV7相互作用的小分子。

在這個(gè)過(guò)程中，作者從LOPAC 文庫(kù)和PRESTWICK 文庫(kù)中篩選了1萬(wàn)個(gè)結(jié)構(gòu)不同的化合物，也在KCB（Korea Chemical Bank）化合物庫(kù)中篩選了具有代表性的化合物。最終鑒定得到JH-RE-06，可以10mM濃度下有效地抑制REV1-REV7相互作用，作為后續(xù)的研究對(duì)象^[1]。

FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer，熒光共振能量轉(zhuǎn)移）基于非輻射的能量躍遷。將一個(gè)蛋白上耦聯(lián)供體（donor），另一個(gè)蛋白上耦聯(lián)受體（acceptor），以下圖為例即供體為CFP，受體為YFP。當(dāng)兩個(gè)蛋白間距離較遠(yuǎn)時(shí)，CFP可以在433nm波長(zhǎng)的熒光激發(fā)下發(fā)射475nm波長(zhǎng)的熒光，而YFP不被激發(fā)；只有當(dāng)供體和受體靠近時(shí)，即兩個(gè)蛋白之間存在相互作用時(shí)，可以發(fā)生FRET，使得YFP被激發(fā)，產(chǎn)生波長(zhǎng)為530nm的熒光。可以應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)分子間相互作用、細(xì)胞膜受體蛋白之間相互作用等研究。而使用高通量藥物篩選平臺(tái)SpectraMax Paradigm的FI卡盒（Fluorescence Intensity）可以同時(shí)完成對(duì)雙熒光信號(hào)的檢測(cè)，檢測(cè)速度更快且結(jié)果更準(zhǔn)確，不受光源強(qiáng)度、電壓等變化的影響。

FRET原理（Yamao, Masataka et al. PloS one. 25 Oct. 2016）

2. Both Boceprevir and GC376 efﬁcaciously inhibit SARS-CoV-2 by targeting its main protease Nature communications 17.694

中國(guó)科學(xué)院微生物研究所齊建勛課題組在Nature Communications上發(fā)表的研究證實(shí)丙肝藥物博賽潑維（Boceprevir）和GC376（臨床前期藥物，針對(duì)貓傳染性腹膜炎病毒的抑制劑）可以通過(guò)靶向新型冠狀病毒的主蛋白酶（main protease，M^pro）起到病毒抑制作用。

Table 1. 18種待篩抗蛋白酶化合物

新冠病毒的主蛋白酶在病毒多聚蛋白的加工和成熟過(guò)程中起到重要作用，也因此是研發(fā)治療新冠病毒藥物的重要靶點(diǎn)。首先，作者發(fā)現(xiàn)了新冠病毒M^pro與其他冠狀病毒M^pro之間的同源性，因此選擇了靶向不同病毒蛋白酶和蛋白酶體的18種化合物進(jìn)行進(jìn)一步篩選（Table 1）。

Figure 1. 高通量藥物篩選

進(jìn)一步作者通過(guò)在單一濃度下，在體外進(jìn)行FRET實(shí)驗(yàn)對(duì)這些化合物進(jìn)行篩選（Figure 1 a, b）。最終發(fā)現(xiàn)有兩種抑制劑，即Boceprevir 和GC376，可以很好地抑制酶活性。RFU值（relative ﬂuorescence units）是在37度的條件下，激發(fā)波長(zhǎng)為360nm，發(fā)射波長(zhǎng)為490nm，使用高通量藥物篩選平臺(tái)SpectraMax Paradigm檢測(cè)1小時(shí)得到^[2]。

3. Involvement of NADPH oxidase 1 in UVB-induced cell signaling and cytotoxicity in human keratinocytes Biochem Biophys Rep. 3.322

Glady, Azela等人在這篇文章中試圖探究UVB-誘導(dǎo)的活性氧的來(lái)源和作用，最終得出結(jié)論：Nox-1介導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生，是UBV通過(guò)p38激活和炎性細(xì)胞因子生成所導(dǎo)致的細(xì)胞毒性和炎癥所必須的，所以，作者認(rèn)為Nox-1可以作為UVB接觸后所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性和炎癥的一個(gè)可能的治療靶點(diǎn)。

在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中作者需要對(duì)細(xì)胞內(nèi)的H₂O₂水平進(jìn)行檢測(cè)，主要通過(guò)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染H₂O₂敏感性探針pHyPer cDNA質(zhì)粒，在完成穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建后通過(guò)使用高通量藥物篩選平臺(tái)SpectraMax Paradigm對(duì)細(xì)胞熒光進(jìn)行檢測(cè)，YFP與CFP激發(fā)波長(zhǎng)的比值用來(lái)衡量細(xì)胞內(nèi)H₂O₂的水平^[3]。

Figure 1G

作者通過(guò)對(duì)Nox1的敲除發(fā)現(xiàn)可以抑制UVB誘導(dǎo)的即時(shí)或遲發(fā)的細(xì)胞內(nèi)H₂O₂水平的升高，可以看出Nox1-siRNA組在UVB處理0.5h、3h和10h時(shí)，YFPex/CFPex的比值顯著低于對(duì)照組（Figure 1G）。

高通量藥物篩選平臺(tái)SpectraMax Paradigm

高通量藥物篩選平臺(tái)SpectraMax Paradigm可以進(jìn)行光吸收、熒光、時(shí)間分辨熒光（包括 HTRF）、熒光偏振、AlphaScreen、AlphaLISA 以及化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)。檢測(cè)卡盒式的模塊化設(shè)計(jì)，不僅可以滿足目前檢測(cè)的需求，還可以根據(jù)未來(lái)應(yīng)用需求靈活的進(jìn)行升級(jí)，通過(guò)插入新功能檢測(cè)卡盒，僅需要短短幾分鐘完成對(duì)讀板機(jī)的升級(jí)，是您藥物篩選的得力助手。

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