本文要點：利用光學(xué)技術(shù)對早期發(fā)育階段的斑馬魚心血管系統(tǒng)進行無創(chuàng)分析時，主要基于傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡元件和圖像傳感器，采集和分析的光的波長范圍在400-900 nm范圍內(nèi)。本文比較了使用可見光和近紅外范圍(VISNIR) 400-1000 nm和短波紅外范圍(SWIR) 900-1700 nm的無創(chuàng)光學(xué)方法。在這些波長范圍內(nèi)測量斑馬魚組織的透射光譜，然后根據(jù)VISNIR和SWIR的數(shù)據(jù)計算血管圖、心率和血流速度。SWIR中記錄了更高的色素圖案透明度，而在此范圍內(nèi)的心臟和血管檢測質(zhì)量不低于VISNIR。所獲得的結(jié)果表明，SWIR成像用于監(jiān)測斑馬魚胚胎和幼蟲的心臟功能和血流動力學(xué)分析的效率更高，并表明與其他受色素模式發(fā)育限制的光學(xué)技術(shù)相比，SWIR成像可支持更長的實驗計劃。

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背景：斑馬魚(Danio Rerio)是一種小型鯉科魚類，是研究脊椎動物包括人類疾病各種過程的最常見的模式生物之一。在過去的幾十年里，由于其基因組中存在人類疾病基因和胚胎的光學(xué)透明度，斑馬魚一直被積極地用于模擬心血管病理。光學(xué)方法是對早期發(fā)育階段的斑馬魚心血管系統(tǒng)進行非侵入性研究的最常見方法。在斑馬魚模型中，這些技術(shù)被用作檢查先天性心臟病、心肌病以及各種因素對心血管系統(tǒng)功能的影響的工具。此外，透明的斑馬魚胚胎可以用于研究心血管表型以及血流動力學(xué)與癌細胞遷移能力的關(guān)系。

 

如今，光學(xué)相干層析成像使斑馬魚內(nèi)部的微米分辨率可視化成為可能。當(dāng)其與光聲學(xué)、血管造影術(shù)或其他成像手段相結(jié)合時，是識別和研究特定組織的可靠工具。共聚焦顯微鏡和光片顯微鏡提供了斑馬魚心臟和血管的更詳細的結(jié)構(gòu)，但需要長期掃描和血細胞標(biāo)記。染料的熒光可以進行準(zhǔn)確的高對比度心血管成像。沒有這兩種顯微鏡及染料，就需要大量的圖像分割和分析算法。無標(biāo)簽且經(jīng)濟實惠的心跳測量和血管測繪的光學(xué)方法主要基于時差分析，也就是說在顯微鏡明場圖像中跟蹤與血液脈動相關(guān)的時間變化。

 

光學(xué)技術(shù)在可見光下的一個重要限制，來自于色素圖案的形成導(dǎo)致的胚胎透明度降低。野生型斑馬魚中黑色素細胞的定位和轉(zhuǎn)變，將使用光學(xué)方法的長期實驗計劃限制在在受精后1-2周。過去開發(fā)了1-苯基-2-硫脲的應(yīng)用和基因組干預(yù)的方法，以達到在更長時間內(nèi)保持斑馬魚胚胎透明度的目的，但基因組干預(yù)或化學(xué)試劑的應(yīng)用可能會影響實驗結(jié)果。此外，實驗計劃可能建議只使用野生斑馬魚。因此，允許忽略黑色素細胞的光學(xué)方法的發(fā)展，關(guān)系到斑馬魚胚胎和魚類胚胎模型的應(yīng)用。

 

SWIR(900-1700 nm)的光學(xué)技術(shù)是克服這一問題的方法之一。該范圍內(nèi)的光具有減少散射和在生物組織中具有更高穿透深度的優(yōu)點。SWIR相機的上市使多種高靈敏度成像方式成為可能。本文通過實驗證明了斑馬魚組織在SWIR中的光學(xué)透明度比在VISNIR中的高，SWIR成像可以更有效地進行典型的心血管成像觀察。

Figure 1

 

這項研究包括兩個階段(圖1)。第一個階段的目的是測量斑馬魚組織的光譜特性，并證明SWIR在光學(xué)透過率方面比VISNIR具有潛在的優(yōu)勢。在第二階段，我們通過計算血管地圖、心率和血流速度，定量比較了VISNIR和SWIR對心血管系統(tǒng)的表征。

Figure 2

 

首先是光學(xué)透明度測量。圖2a和2b顯示了眼睛、卵黃、肌肉、心臟和耳石的VISNIR(400-900 nm)和SWIR(900-1700 nm)圖像，這些器官具有不同的結(jié)構(gòu)和特性。本文手動選擇與它們相關(guān)的區(qū)域(圖2c中的彩色陰影區(qū)域)并標(biāo)記顏料圖案，以查看其在VISNIR中的弱透明度在SWIR中是否有所不同。通過在顯微鏡照明系統(tǒng)中安裝窄帶濾光片，獲得了15幅斑馬魚麻醉后的光譜圖像，計算了選定器官I(λi)(i=1，2，…，15)和無標(biāo)本背景B(λi)的平均強度隨波長的變化關(guān)系，并計算了T(λi)=I(λi)/B(λi)的透射譜。圖2d顯示了超過5個樣本的平均箱線圖T(λi)。由于圖2d中灰色垂直條紋所示的1450 nm附近的高吸水率，認(rèn)為該波長帶內(nèi)的T(λi)的值是不可靠的，因此跳過它。圖2d中顯示的數(shù)據(jù)清楚地表明，在SWIR中，所有斑馬魚器官的光透過率T(λi)增加了1.5-2.5倍。肌肉、卵黃、心臟和色素皮膚在850-1600 nm的整個范圍內(nèi)始終保持70%-90%的透明度。

Figure 3

 

接著進行心血管研究，首先是血管成像研究。圖3展示了斑馬魚身體的典型VISNIR和SWIR圖像。一旦原始序列的圖像被匹配，通過視頻毛細血管鏡即可計算血流圖，即通過突出顯示強度變化對應(yīng)于心臟活動的像素來計算強度變化的二維分布和血管圖像。從VISNIR圖像（上行）中檢測嚴(yán)重色素沉著區(qū)域的血管幾乎是不可能的。在圖3所示的個體中，標(biāo)有黃色的色素圖案覆蓋了大部分的主靜脈和部分節(jié)段動脈，這就導(dǎo)致在重建的血管圖像中沒有這些血管（圖3b上行）。而在SWIR圖像中，該色素是透明的（圖3a下行），因此幾乎不影響SWIR圖像處理算法的血流檢測能力。從SWIR系列圖像重建的血管圖顯示了更詳細的血管結(jié)構(gòu)，包括那些被色素沉積圖案隱藏的血管（圖3b下行）。

 

Figure 4

 

收集8張重疊20%-30%的圖像，計算血管地圖，并將它們拼接成無縫全景圖，在VISNIR和SWIR中獲得整個動物的高分辨率血管圖像(圖4)。在SWIR全景圖(圖4b)中，可以在頭部、身體和尾部看到多條血管，這些血管在VISNIR(圖4a)中是不存在的。同樣，由于SWIR的透明度，魚全身的色素沉著幾乎不會影響光學(xué)測量。

Figure 5

 

其次是心率的測量。心率是心臟功能和整體健康的主要指標(biāo)。它的測量最直接的方法之一是光體積描記術(shù)(PPG)，即跟蹤血液循環(huán)的體積變化。本文在VISNIR和SWIR中實現(xiàn)了這種心率測量方法。本文選擇了心臟區(qū)域(圖5a中用彩色框突出顯示)，并計算了其平均強度的時間依賴性（圖5b）。在減去低頻分量之后，得到可以分析和比較的歸一化PPG信號(圖5c)。實驗表明，VISNIR和SWIR成像都能提供清晰穩(wěn)定的周期性PPG信號。雖然VISNIR中的心跳信號的幅度是VISNIR的4-5倍，形狀更詳細，但這兩種信號都很適合心率測量。在圖6所示的例子中，用VISNIR和SWIR測量的心率分別為161次/分和164次/分。這些值與過往研究中獲得的數(shù)據(jù)接近。

Figure 6

 

最后是血流速度的測量。血流速度是定量描述心功能和了解心血管血流動力學(xué)至關(guān)重要的參數(shù)。圖6a顯示了在VISNIR和SWIR中獲取的斑馬魚身體的原始圖像。選擇了大動脈(紅色)和主靜脈(藍色)的區(qū)域(見圖6a和6b)，通過檢測這些血管的中心線并計算每個點的法線，將它們的軌跡轉(zhuǎn)換為直線，并跟蹤相鄰圖像之間的相對位移，血流速度即可以計算為該位移和50赫茲的幀速率的乘積。在VISNIR中，色素沉著的圖案幾乎完全覆蓋了大靜脈(見圖6a)。因此，血流速度的檢測和分析只有在短波紅外中才是可行的。圖6b顯示了腹主動脈和主靜脈血流速度的時間依賴關(guān)系。腹主動脈和基底靜脈信號的相移、形狀、速度值(VISNIR：576±450μm/s，SWIR：574±510μm/s和564±112μm/s)以及其他特征與用其他方法獲得的數(shù)據(jù)很好地吻合。同時還可以通過簡單的頻率分析從這些信號中提取心率。在圖6所示的例子中，VISNIR為161 bpm，SWIR為164 bpm。這些值與從心臟區(qū)域的PPG信號獲得的值一致(圖5c)。

 

Table 1

 

Table 2

 

表2總結(jié)了與在VISNIR和SWIR中對兩種斑馬魚4 dpf胚胎進行的心血管研究相關(guān)的量化數(shù)據(jù)。PPG信號的信噪比(SNR)反映了心臟活動測量的可靠性。血管密度被定義為與檢測到的血流的血管相關(guān)的像素與樣本占據(jù)的總像素量的比例。表2中的量化數(shù)據(jù)顯示了SWIR心血管研究相對于傳統(tǒng)VISNIR成像的優(yōu)勢。由于斑馬魚器官的透明度和色素沉著，SWIR圖像的處理在血管測繪和血流速度測量方面更具信息量和可靠性。

 

討論：本文對VISNIR和SWIR成像的評估顯示，SWIR中的斑馬魚組織的光學(xué)透過率顯著增加，色素圖案更透明。同時，在此范圍內(nèi)獲得的圖像的心臟和血管檢測質(zhì)量不遜于VISNIR。

 

SWIR成像允許將野生型斑馬魚的成像周期延長2-3周，并放棄遺傳或生化操作以增加組織透明度。這種方法可用于在斑馬魚模型中建立復(fù)雜的長期實驗計劃（例如，在研究藥物的藥效學(xué)、藥物和異生素的延遲效應(yīng)和生物蓄積、血液中循環(huán)腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移動力學(xué)等）。

 

斑馬魚是目前生物醫(yī)學(xué)實驗中最受歡迎的魚類。如今，硬骨魚中的一些其他魚類被探索來模擬人類疾病。由于魚類的早期發(fā)育的相似性，SWIR成像很有可能作為非侵入性光學(xué)方法，在大多數(shù)硬骨魚的早期發(fā)育階段用于研究其心血管功能和血管造影。

 

結(jié)論:與VISNIR相比，斑馬魚組織及其色素圖案在SWIR中表現(xiàn)出更高的透明度。這一發(fā)現(xiàn)擴大了光學(xué)技術(shù)用于心血管研究的范圍，如監(jiān)測心臟活動和血流成像。即使在存在色素的情況下，SWIR成像也可以對位于色素后面的血管進行非侵入性測繪和量化。這項研究的結(jié)果可能會提高多種光學(xué)技術(shù)(光體積描記、光學(xué)相干斷層掃描、高光譜成像等)的效率，同時這些光學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于研究斑馬魚的發(fā)育動力學(xué)和紊亂。

 

參考文獻

Volkov, M.; Machikhin, A.; Bukova, V.; Khokhlov, D.; Burlakov, A.; Krylov, V., Optical transparency and label-free vessel imaging of zebrafish larvae in shortwave infrared range as a tool for prolonged studying of cardiovascular system development. Sci Rep 2022, 12 (1), 20884.

 

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