過去的一年，在其它創(chuàng)新藥領(lǐng)域面對市場寒冬時(shí)，細(xì)胞與基因治療仍然一路高歌猛進(jìn)，愈發(fā)受到資本市場的青睞。據(jù)深藍(lán)觀不完全統(tǒng)計(jì)，2022年全球細(xì)胞與基因治療(Cell and Gene Threapy, CGT)市場的融資規(guī)模已達(dá)到200億美元，被寄予了很高的期望，可謂風(fēng)云正起。CGT中最具代表性的案例是嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法(Chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy, CAR-T)，目前該療法已有八款產(chǎn)品獲批上市，治愈了全球數(shù)以萬計(jì)的血液腫瘤患者。CAR-T也已經(jīng)不甘于原先血液疾病的窄小應(yīng)用，正在逐漸探索實(shí)體瘤領(lǐng)域的可能性。

但CAR-T療法在商業(yè)化的過程中涌現(xiàn)出來的問題也值得我們深思。首先是高昂的定價(jià)讓很多患者望而卻步，目前上市的療法中大多都處于供不應(yīng)求的狀態(tài)，有的患者甚至要等候六個(gè)月才能接受CAR-T治療。現(xiàn)階段的CAR-T療法遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足患者的需求，產(chǎn)能不足嚴(yán)重限制了CAR-T療法的前景。其中慢病毒載體的產(chǎn)能不足是被吐槽最嚴(yán)重的一個(gè)缺陷，其面臨的困境主要包括生產(chǎn)成本昂貴、生產(chǎn)耗時(shí)過長、工藝難以規(guī)范等。慢病毒載體的生產(chǎn)成本約占 CAR-T療法總成本的1/3，且因?yàn)槿狈π兄�有效且快速的質(zhì)控手段，導(dǎo)致慢病毒的生產(chǎn)過程非常漫長。因此，建立成熟可靠的病毒載體質(zhì)量控制體系對于整個(gè)CAR-T療法甚至CGT領(lǐng)域意義非凡。今天小編重點(diǎn)為您介紹一種Robust的技術(shù)方法，助您在CGT載體研發(fā)、生產(chǎn)質(zhì)控中做到降本增效。

慢病毒載體及表征現(xiàn)狀
首先，我們來了解一下慢病毒。慢病毒載體（結(jié)構(gòu)如圖1）是以HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒, 80-120 nm）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，主要由莢膜、蛋白殼及內(nèi)部包裹的RNA構(gòu)成。慢病毒載體可以將外源基因有效地整合到宿主細(xì)胞的染色體上，從而實(shí)現(xiàn)外源基因的穩(wěn)定表達(dá)。
 

圖1. 慢病毒結(jié)構(gòu)示意圖

目前慢病毒滴度的檢測方法主要有如下幾種：

1. 基于病毒侵染活性的轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度法(transducing units, TU)；

2. 基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)的基因組的拷貝數(shù)測定；

3. 基于酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)的病毒p24蛋白濃度分析；

以上三種方法因其在檢測某一指標(biāo)時(shí)固有的優(yōu)勢而被廣泛應(yīng)用，但無一例外，三種方法都是基于整體特征檢測的bulk方法，難以揭示病毒樣品的異質(zhì)性，此外，耗時(shí)長、對樣品純度要求高、無法評估樣品純度等問題也是傳統(tǒng)方法的局限性。

慢病毒載體能否將基因傳遞到宿主細(xì)胞有兩個(gè)關(guān)鍵因素:
1.識(shí)別：病毒外膜VSV-G蛋白（一種水泡性口炎病毒G糖蛋白）的表達(dá)，決定了與宿主細(xì)胞表面的受體的特異性結(jié)合；

2.遞送“貨物”：慢病毒成功裝載了目的基因。

因而在優(yōu)化病毒載體的生產(chǎn)工藝時(shí)，表面膜蛋白的表達(dá)及內(nèi)部核酸的裝載均應(yīng)該成為關(guān)注的關(guān)鍵點(diǎn)。

在臨床應(yīng)用中，慢病毒作為細(xì)胞與基因治療的常用載體，相關(guān)制劑的純度和質(zhì)量均需符合GMP標(biāo)準(zhǔn)。而慢病毒生產(chǎn)過程中會(huì)引入非病毒成分的雜質(zhì)（如細(xì)胞碎片、蛋白聚集體）和病毒成分的雜質(zhì)（如空殼病毒、游離RNA等）。因此，對生產(chǎn)過程中以及慢病毒終產(chǎn)品進(jìn)行多維度的定量分析必不可少，亟需一種快速、高通量的慢病毒顆粒滴度、純度、空殼率等指標(biāo)的檢測方法。

NanoFCM解決方案
NanoFCM（圖2）基于自身的技術(shù)平臺(tái)開發(fā)了一種高靈敏、快速、直接、無創(chuàng)的病毒檢測方法，該方法操作簡單、檢測速度快、準(zhǔn)確性高、適用性廣，適用于不同種類的病毒樣顆粒和病毒載體的分析。同一分析中，僅需（10 uL）上樣量，且單次檢測樣品消耗量不足1 uL，在單顆粒水平對粒徑及分布、顆粒濃度等物理參數(shù)表征的基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步對慢病毒的多種結(jié)構(gòu)組分：VSV-G蛋白、基因組、衣殼蛋白、莢膜等進(jìn)行精確分析，實(shí)現(xiàn)慢病毒載體樣品的綜合表征，NanoFCM為慢病毒顆粒滴度、純度、空殼率等信息提供快速檢測方案，且該多參數(shù)檢測方案僅需2-3 min即可獲得高通量并具有統(tǒng)計(jì)代表性的數(shù)據(jù)結(jié)果，在前期研發(fā)、生產(chǎn)、純化、質(zhì)控、穩(wěn)定性評估等各個(gè)階段均具有極高的應(yīng)用價(jià)值。
 

圖2. NanoFCM儀器圖示

NanoFCM在慢病毒表征中的應(yīng)用
01 不同研發(fā)生產(chǎn)階段慢病毒樣品中病毒相關(guān)組分檢出
憑借超高的散射和熒光檢測靈敏度，NanoFCM可實(shí)現(xiàn)對慢病毒（80-120 nm）粒徑范圍內(nèi)不同組分的表征，也可實(shí)現(xiàn)樣本環(huán)境中單個(gè)游離RNA的檢測。如下圖3所示，通過對慢病毒樣品的遞送“貨物”核酸和病毒外膜VSV-G“識(shí)別”蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記，NanoFCM在2-3 min內(nèi)就可以區(qū)分完整病毒、空殼、游離核酸等不同結(jié)構(gòu)，助力研發(fā)和生產(chǎn)階段的病毒質(zhì)量評估。

圖3. 功能性慢病毒顆粒檢測

02 慢病毒粒徑分布及顆粒濃度表征
NanoFCM以每分鐘高達(dá)上萬個(gè)顆粒的檢測速率實(shí)現(xiàn)單個(gè)慢病毒的逐一檢測，獲得具有統(tǒng)計(jì)代表性的粒徑分布和濃度信息（如下圖4所示），也可快速獲得不同亞群的信息，對慢病毒樣品進(jìn)行梯度稀釋，NanoFCM的檢測結(jié)果與稀釋度呈現(xiàn)很好的線性結(jié)果（R2>0.99）。這種多、快、省的檢測方法，可用于慢病毒生產(chǎn)過程中增殖狀態(tài)的實(shí)時(shí)監(jiān)控。

圖4. 慢病毒粒徑、濃度和稀釋線性測試

03慢病毒生化性質(zhì)定性、定量分析
此外，NanoFCM還可基于一定的標(biāo)記策略，實(shí)現(xiàn)純度、核酸包裹效率、內(nèi)膜蛋白p24檢測、不同工藝VSV-G蛋白等生化指標(biāo)的快速測定→詳細(xì)的檢測方案可聯(lián)系NanoFCM客服獲取。

04對標(biāo)經(jīng)典方法
基于NanoFCM發(fā)展的慢病毒定量分析方法與轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度的結(jié)果對比（如圖5），結(jié)果表明該慢病毒的particle-to-PFU ratio為100以上，針對p24蛋白的ELISA病毒滴度測定極易受游離p24蛋白的影響；相比之下NanoFCM所得結(jié)果與病毒的物理滴度更為吻合。
 

圖5. 慢病毒滴度測定

小結(jié)
NanoFCM全新發(fā)布的慢病毒解決方案一經(jīng)推出，引發(fā)領(lǐng)域研究者的關(guān)注和討論熱潮，截止目前，已有多家領(lǐng)域頭部的企事業(yè)單位，購買了納米流式檢測儀。究其原因是，NanoFCM提供了一種單顆粒水平、無創(chuàng)且快速的慢病毒多維表征方案，解決了傳統(tǒng)表征方法耗時(shí)、整體性檢測無法揭示樣品異質(zhì)性的問題，為已有的檢測方法提供更快速的正交和驗(yàn)證手段，可廣泛應(yīng)用于慢病毒載體構(gòu)建的研發(fā)、工藝優(yōu)化及質(zhì)控等環(huán)節(jié)，助力CGT企業(yè)的病毒載體質(zhì)控。