單細胞測序在對非小細胞肺癌微環(huán)境于免疫治療中動態(tài)變化研究的應用
抗PD-(L)1免疫檢查點抑制治療已成為晚期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的一線治療方案。對于早期可切除NSCLC，近年來新輔助免疫治療的方案顯示出良好的治療前景。然而，仍然只有約40%的早期NSCLC在新輔助免疫治療后達到主要病理緩解（major pathologic response，MPR），大部分患者依舊對治療抵抗【1】。腫瘤微環(huán)境（Tumor microenvironment，TME）對于腫瘤治療耐藥有重要作用，而治療本身又可重塑TME。解析免疫治療和TME的相互作用可能是解決NSCLC免疫治療抵抗的關鍵突破口。盡管免疫治療在晚期NSCLC已實踐多年，但是關于免疫治療對肺癌TME作用的研究仍然很缺乏。
近日，同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院張鵬課題組與同濟大學生命科學與技術學院王晨飛課題組與合作，于Genome Medicine 雜志在線發(fā)表題為Tumor Microenvironment Remodeling after Neoadjuvant Immunotherapy in Non-small Cell Lung Cancer Revealed by Single-Cell RNA Sequencing的研究論文。該研究利用單細胞及大量細胞轉(zhuǎn)錄組測序（single-cell and bulk RNA-seq）、非靶向代謝組學以及多色熒光染色系統(tǒng)刻畫NSCLC的TME在新輔助免疫治療中的動態(tài)變化，鑒定出新的生物標志物以及潛在的耐藥的新機制。
接著研究人員進一步分析各個免疫細胞亞群的動態(tài)變化。對比TN組，MPR和NMPR組的CD8+ T細胞和NK細胞均被激活，但是MPR組的殺傷性CD8+ T細胞和CD16+ NK細胞更多，且Treg更少。在CD20+ B細胞中，發(fā)現(xiàn)了一群高表達CD86的FCRL4+FCRL5+ 非經(jīng)典記憶B細胞亞群【2】富集在MPR患者中。進一步通過多色熒光染色發(fā)現(xiàn)這群B細胞位于三級淋巴結(jié)構(gòu)（tertiary lymphoid structures，TLS）的中心部位。在獨立的驗證隊列中，MPR患者基線期的這群FCRL4+FCRL5+ B細胞的富集程度更高。此外，作者在另外兩個黑色素瘤隊列中也發(fā)現(xiàn)這群B細胞在反應者的富集程度高于無反應者。細胞互作分析發(fā)現(xiàn)這群B細胞可以通過CD86-CD28和CD40-CDLG激活濾泡輔助T細胞（follicular helper T，Tfh）產(chǎn)生IL21，而IL21可進一步激活CD8+ T細胞【3】。
通過分析髓系細胞的異質(zhì)性，作者發(fā)現(xiàn)CD16+CX3CR1+ 的“巡邏”單核細胞[4]在MPR患者中富集，可能通過分泌CFP誘導腫瘤細胞凋亡。其信號的富集同樣可預測好的免疫治療效果（圖4）。由于采用BD單細胞測序平臺，作者獲得了較多的中性粒細胞。聚類后分為成熟和衰老的各兩個亞群，其中一群CCL3+ 的衰老中性粒細胞在MPR中明顯減少且在NMPR組中增加，而這群衰老的中性粒高表達PD-L1和IDO1等免疫檢查點且趨化因子IL8。通過細胞互作分析，作者發(fā)現(xiàn)CCL3+ 的衰老中心�？赡芎蚐PP1+ 巨噬細胞存在著正反饋調(diào)節(jié)以互相促進增加：SPP1+巨噬細胞分泌SPP1誘導中性粒向衰老CCL3+ 表型轉(zhuǎn)化，而這群中性粒則分泌CCL3、CCL4等趨化因子反過來招募更多的SPP1+ 巨噬細胞。
綜上，本文利用臨床免疫治療前后的腫瘤以及外周血樣本，通過單細胞測序系統(tǒng)刻畫了免疫治療過程TME的變化，為后續(xù)肺癌免疫治療研究提供了珍貴的數(shù)據(jù)支持。作者對比MPR和NMPR的TME差異，提出FCRL4+FCRL5+ B細胞、CD16+CX3CR1+單核細胞和血漿雌激素變化特征是新的生物標志物，并在獨立和公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中驗證。結(jié)合BD平臺捕獲單細胞的優(yōu)勢，系統(tǒng)分析了免疫過程中中性粒細胞和治療應答之間的關系。
同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院張鵬教授和同濟大學生命科學與技術學院王晨飛研究員為該論文共同通訊作者，同濟大學博士生胡俊杰、嚴以律、同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院助理研究員張樂樂和南昌大學醫(yī)學院碩士研究生夏浩然為共同第一作者。
原文鏈接：
https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-023-01164-9
參考文獻
1. Forde PM, Spicer J, Lu S, Provencio M, Mitsudomi T, Awad MM, et al. Neoadjuvant Nivolumab plus Chemotherapy in Resectable Lung Cancer. N Engl J Med. 2022; 386:1973-1985.
2. Li H, Dement-Brown J, Liao PJ, Mazo I, Mills F, Kraus Z, et al. Fc receptor-like 4 and 5 define human atypical memory B cells. Int Immunol. 2020; 32:755-770.
3. Cui C, Wang J, Fagerberg E, Chen PM, Connolly KA, Damo M, et al. Neoantigen-driven B cell and CD4 T follicular helper cell collaboration promotes anti-tumor CD8 T cell responses. Cell. 2021; 184:6101-6118.e6113.
4. Hanna RN, Cekic C, Sag D, Tacke R, Thomas GD, Nowyhed H, et al. Patrolling monocytes control tumor metastasis to the lung. Science. 2015; 350:985-990.
近日，同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院張鵬課題組與同濟大學生命科學與技術學院王晨飛課題組與合作，于Genome Medicine 雜志在線發(fā)表題為Tumor Microenvironment Remodeling after Neoadjuvant Immunotherapy in Non-small Cell Lung Cancer Revealed by Single-Cell RNA Sequencing的研究論文。該研究利用單細胞及大量細胞轉(zhuǎn)錄組測序（single-cell and bulk RNA-seq）、非靶向代謝組學以及多色熒光染色系統(tǒng)刻畫NSCLC的TME在新輔助免疫治療中的動態(tài)變化，鑒定出新的生物標志物以及潛在的耐藥的新機制。
單細胞轉(zhuǎn)錄組測序由伯豪生物提供服務
在該研究中，作者收集了15例IIIA期NSCLC新輔助免疫治療前后的原發(fā)腫瘤樣本進行單細胞測序，這些樣本被分為治療前（treatment-naïve，TN），治療后病理緩解組（MPR）以及非病理緩解組（NMPR）三組。此外作者還對另外21例新輔助免疫治療基線期的原發(fā)腫瘤樣本進行bulk 轉(zhuǎn)錄組測序，作為獨立的驗證隊列（圖一）。質(zhì)控后總共獲得92330個單細胞，聚類后分為上皮細胞、T細胞、B細胞、髓系細胞等。作者首先探索了腫瘤細胞在治療前后轉(zhuǎn)錄特征。通過三個組間的對比，發(fā)現(xiàn)MPR組的腫瘤細胞呈現(xiàn)出免疫激活的特征（高表達免疫細胞趨化因子CX3CL1和MHC-II相關分子），而NMPR組則高表達雌激素代謝相關的基因（AKR1C1-3）以及富集雌激素相關的通路。進一步作者通過非靶向代謝組證實NMPR患者在治療過程中會出現(xiàn)血漿雌激素水平升高。圖1 研究樣本組成
接著研究人員進一步分析各個免疫細胞亞群的動態(tài)變化。對比TN組，MPR和NMPR組的CD8+ T細胞和NK細胞均被激活，但是MPR組的殺傷性CD8+ T細胞和CD16+ NK細胞更多，且Treg更少。在CD20+ B細胞中，發(fā)現(xiàn)了一群高表達CD86的FCRL4+FCRL5+ 非經(jīng)典記憶B細胞亞群【2】富集在MPR患者中。進一步通過多色熒光染色發(fā)現(xiàn)這群B細胞位于三級淋巴結(jié)構(gòu)（tertiary lymphoid structures，TLS）的中心部位。在獨立的驗證隊列中，MPR患者基線期的這群FCRL4+FCRL5+ B細胞的富集程度更高。此外，作者在另外兩個黑色素瘤隊列中也發(fā)現(xiàn)這群B細胞在反應者的富集程度高于無反應者。細胞互作分析發(fā)現(xiàn)這群B細胞可以通過CD86-CD28和CD40-CDLG激活濾泡輔助T細胞（follicular helper T，Tfh）產(chǎn)生IL21，而IL21可進一步激活CD8+ T細胞【3】。
通過分析髓系細胞的異質(zhì)性，作者發(fā)現(xiàn)CD16+CX3CR1+ 的“巡邏”單核細胞[4]在MPR患者中富集，可能通過分泌CFP誘導腫瘤細胞凋亡。其信號的富集同樣可預測好的免疫治療效果（圖4）。由于采用BD單細胞測序平臺，作者獲得了較多的中性粒細胞。聚類后分為成熟和衰老的各兩個亞群，其中一群CCL3+ 的衰老中性粒細胞在MPR中明顯減少且在NMPR組中增加，而這群衰老的中性粒高表達PD-L1和IDO1等免疫檢查點且趨化因子IL8。通過細胞互作分析，作者發(fā)現(xiàn)CCL3+ 的衰老中心�？赡芎蚐PP1+ 巨噬細胞存在著正反饋調(diào)節(jié)以互相促進增加：SPP1+巨噬細胞分泌SPP1誘導中性粒向衰老CCL3+ 表型轉(zhuǎn)化，而這群中性粒則分泌CCL3、CCL4等趨化因子反過來招募更多的SPP1+ 巨噬細胞。
綜上，本文利用臨床免疫治療前后的腫瘤以及外周血樣本，通過單細胞測序系統(tǒng)刻畫了免疫治療過程TME的變化，為后續(xù)肺癌免疫治療研究提供了珍貴的數(shù)據(jù)支持。作者對比MPR和NMPR的TME差異，提出FCRL4+FCRL5+ B細胞、CD16+CX3CR1+單核細胞和血漿雌激素變化特征是新的生物標志物，并在獨立和公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中驗證。結(jié)合BD平臺捕獲單細胞的優(yōu)勢，系統(tǒng)分析了免疫過程中中性粒細胞和治療應答之間的關系。
同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院張鵬教授和同濟大學生命科學與技術學院王晨飛研究員為該論文共同通訊作者，同濟大學博士生胡俊杰、嚴以律、同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院助理研究員張樂樂和南昌大學醫(yī)學院碩士研究生夏浩然為共同第一作者。
原文鏈接：
https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-023-01164-9
參考文獻
1. Forde PM, Spicer J, Lu S, Provencio M, Mitsudomi T, Awad MM, et al. Neoadjuvant Nivolumab plus Chemotherapy in Resectable Lung Cancer. N Engl J Med. 2022; 386:1973-1985.
2. Li H, Dement-Brown J, Liao PJ, Mazo I, Mills F, Kraus Z, et al. Fc receptor-like 4 and 5 define human atypical memory B cells. Int Immunol. 2020; 32:755-770.
3. Cui C, Wang J, Fagerberg E, Chen PM, Connolly KA, Damo M, et al. Neoantigen-driven B cell and CD4 T follicular helper cell collaboration promotes anti-tumor CD8 T cell responses. Cell. 2021; 184:6101-6118.e6113.
4. Hanna RN, Cekic C, Sag D, Tacke R, Thomas GD, Nowyhed H, et al. Patrolling monocytes control tumor metastasis to the lung. Science. 2015; 350:985-990.
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