圖1. nFCM評估EVs藥物裝載策略

圖2. EVs的鑒定和表征

載藥策略對比
由于Dox具有自發(fā)熒光特性，與未裝載Dox的EVs相比，裝載了Dox的EVs表現(xiàn)出明顯的橙色熒光信號，陽性顆粒的比例可達(dá)46.3%；在共孵育方法中，隨著Dox濃度的增加，陽性EVs的比例持續(xù)上升，當(dāng)Dox濃度為100 μM時，EVs的陽性率達(dá)到最高，接近50%（圖3）；

以優(yōu)化后的Dox濃度(100 μM)為參考，評估對比了共孵育、電穿孔、擠出法、反復(fù)凍融、超聲和表面活性劑處理這六種方法對EVs載藥效率、顆粒濃度、藥物裝載量等影響。結(jié)果顯示共孵育和電穿孔法具有最高的裝載效率，均為40%以上，而其他幾種藥物裝載策略陽性率在20%-30%之間（圖3）。總的來說，考慮到藥物包封率、顆粒濃度、藥物裝載量等因素，共孵育和電穿孔是這幾種方法中最理想的EVs藥物裝載策略。
 

圖3. 不同藥物裝載策略的載藥效率、藥物裝載量對比

生物功能分析
EVs表面蛋白是其功能形式的重要參與者，對EVs的免疫逃逸和靶向具有重要作用，作者進(jìn)一步研究了不同藥物裝載策略對EVs表面蛋白的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共孵育和電穿孔方法處理后EVs的表面蛋白(CD24、CD47、CD63)表達(dá)比例相對更高，說明這兩種方法能夠最大限度地保持了EVs的生物活性，而擠出法、反復(fù)凍融、超聲和表面活性劑處理都會不同程度地破壞EVs的表面蛋白（圖4）。
 

圖4. 不同載藥策略對EVs表面蛋白的影響

作者進(jìn)一步評估了不同策略所得載藥EVs中藥物穩(wěn)定性和活性（圖5）。結(jié)果顯示在4℃和-80℃條件下保存，隨著時間的延長，六種裝載策略獲得的EVs陽性率均出現(xiàn)下降，而共孵育方法獲得的EVs在長期保存下還能保持較高的藥物包裹效率（約40%）。綜上，無論何種載藥方式，都建議將裝載Dox的EVs儲存在4℃，且共孵育制備的Dox-EVs顯示出最高的包封率和穩(wěn)定性。
 

圖5. 載藥后EVs的穩(wěn)定性研究

藥物作用效果
作者還探究了不同藥物裝載策略所得Dox-EVs的藥物活性和細(xì)胞攝取效率。共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果均證實(shí)電穿孔的方法獲得的EVs具有更高的細(xì)胞攝取效率，同時更容易誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（圖6）。該結(jié)果與nFCM測定的不同方法藥物包封效率和藥物包裹量相吻合，說明了Dox-EVs的治療效果與細(xì)胞攝取率密切相關(guān)，并從本質(zhì)上與Dox的包封率有關(guān)，揭示了利用nFCM對EVs進(jìn)行單顆粒載藥表征的準(zhǔn)確性和重要價值。
 

圖6. 不同載藥策略的藥物活性

總結(jié)
本研究利用nFCM在單EV水平對六種不同的載藥策略進(jìn)行了全面的評估。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：

• 共孵育和電穿孔方法可以獲得更高的裝載效率，單個EVs中Dox含量也最高；

• 共孵育和電穿孔方法制備的EVs藥物具有更高水平的細(xì)胞攝取和更顯著的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡；

• 共孵育方法獲得的EVs無論在4℃或-80℃長期保存條件下，均具有更好的穩(wěn)定性；

nFCM作為一個高效的單顆粒表征平臺，可應(yīng)用于EVs研究的各個環(huán)節(jié)，包括分離純化、質(zhì)量控制、EVs載藥方法評估和優(yōu)化、穩(wěn)定性監(jiān)測等方面，加速推進(jìn)EVs產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展！

參考文獻(xiàn)
Chen, C., Li, Y., Wang, Q. et al. Single-particle assessment of six different drug-loading strategies for incorporating doxorubicin into small extracellular vesicles. Anal Bioanal Chem 415, 1287–1298 (2023). https://doi.org/10.1007/s00216-022-04248-4