高通量測序后的下游實驗驗證方法之m6A RNA甲基化篇
此前，我們分享了m6A RNA甲基化研究的數(shù)據(jù)挖掘思路，進(jìn)而篩選出m6A修飾目標(biāo)基因。
做完MeRIP-seq測序后，如果需要對分析結(jié)果中感興趣的內(nèi)容進(jìn)行后期驗證，則需要進(jìn)行下游實驗設(shè)計。m6A RNA甲基化修飾目標(biāo)基因的進(jìn)一步驗證或后期試驗包括以下6個方面：
（1）簡單驗證
A. 目標(biāo)基因m6A甲基化的驗證：MeRIP-RT-PCR
B. 檢測目標(biāo)基因的mRNA表達(dá)水平：RT-qPCR
C. 檢測目標(biāo)基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平：Western blot
（2）全局m6A甲基化干擾實驗（非靶向），驗證m6A甲基化書否真的影響目標(biāo)基因表達(dá)和細(xì)胞功能
A. m6A甲基化干擾：m6A writers/erasers的突變/敲降/敲除/過表達(dá)、m6A甲基化抑制劑
如環(huán)亮氨酸、m6A去甲基化抑制劑如FTO抑制劑FB23-2
B. 檢測m6A甲基化整體變化：m6A甲基化免疫熒光染色（定性）、m6A斑點雜交（定性）、比色法（定量）、質(zhì)譜法（定量）
C. 檢測目標(biāo)基因的m6A甲基化變化：MeRIP-qPCR
D. 檢測目標(biāo)基因的mRNA水平：RT-qPCR
E. 檢測目標(biāo)基因蛋白質(zhì)水平：Western blot
F. 檢測細(xì)胞功能/表型變化
（3）靶向目標(biāo)基因的甲基化/去甲基化實驗，檢測某區(qū)域m6A修飾是否真的影響目標(biāo)基因的表達(dá)
A. 目的基因m6A甲基化干擾細(xì)胞系的構(gòu)建：熒光素酶活性分析實驗（Luciferase activity assay）——構(gòu)建含甲基化/未甲基化m6A位點的目標(biāo)基因-熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞并表達(dá)。
B. 檢測目標(biāo)基因的m6A甲基化變化：MeRIP-qPCR
C. 檢測熒光素酶報告基因的mRNA表達(dá)水平：RT-qPCR
D. 檢測目標(biāo)基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平：Western blot
E. 檢測細(xì)胞功能受到的影響：免疫熒光顯微觀察、功能標(biāo)志物測定... ...
用于驗證目標(biāo)基因上m6A甲基化功能的雙熒光素酶報告系統(tǒng)
（4）研究目標(biāo)基因的m6A甲基化如何影響目標(biāo)基因表達(dá)
A. 檢測m6A是否通過影響目標(biāo)基因翻譯而影響蛋白質(zhì)水平：
Polysome profiling
Ribo-seq
通過對結(jié)合核糖體上的mRNA進(jìn)行定量，分析目標(biāo)基因的蛋白翻譯效率
Polysome Profiling方法舉例：
siMETTL3/14對目標(biāo)基因與與核糖體的結(jié)合造成影響，對內(nèi)參基因GAPDH無影響。
B. 研究m6A是否通過調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性和降解而影響目標(biāo)基因蛋白水平
研究m6A對目標(biāo)基因mRNA水平的影響
RT-qPCR
RNA-seq
METTL3/14干擾后，采用RT-PCR和RNA-seq檢測目標(biāo)基因的mRNA水平是否收到影響
C. 研究m6A是否通過調(diào)控RNA的出核（nuclear export）而影響目標(biāo)基因蛋白水平
裂解細(xì)胞，超速離心分離細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)，然后分別進(jìn)行RT-PCR實驗檢測細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中的mRNA水平
METTL3/14干擾后，采用RT-PCR檢測目標(biāo)基因在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中的mRNA水平是否受到影響
（5）m6A修飾目標(biāo)基因的表達(dá)回復(fù)實驗
A. writers的突變/敲降/敲除實驗：
RT-PCR檢測目標(biāo)基因的mRNA水平變化
Western blot檢測目標(biāo)基因的蛋白水平變化
檢測目標(biāo)基因的功能
B. writers的突變/敲降/敲除后，目標(biāo)基因的過表達(dá)回復(fù)實驗：
檢測各項表型指數(shù)、細(xì)胞增殖、分化的回復(fù)情況
METTL3敲除后，靶基因Ezh2的蛋白表達(dá)受到影響。而靶基因Ezh2過表達(dá)回復(fù)實驗會消除METTL3敲除對細(xì)胞增殖分化的不利影響
（6）研究特定m6A Readers通過結(jié)合目標(biāo)基因RNA而影響目標(biāo)基因的蛋白表達(dá)
YTHDF1引入突變后，檢測其假定靶基因的表達(dá)和與靶基因的結(jié)合是否受到影響
做完MeRIP-seq測序后，如果需要對分析結(jié)果中感興趣的內(nèi)容進(jìn)行后期驗證，則需要進(jìn)行下游實驗設(shè)計。m6A RNA甲基化修飾目標(biāo)基因的進(jìn)一步驗證或后期試驗包括以下6個方面：
- 簡單驗證
- 全局m6A甲基化干擾實驗（非靶向），驗證m6A甲基化書否真的影響目標(biāo)基因表達(dá)和細(xì)胞功能
- 靶向目標(biāo)基因的甲基化/去甲基化實驗，檢測某區(qū)域m6A修飾是否真的影響目標(biāo)基因的表達(dá)
- 研究目標(biāo)基因的m6A甲基化如何影響目標(biāo)基因表達(dá)
- m6A修飾目標(biāo)基因的表達(dá)回復(fù)實驗
- 研究特定m6A Readers通過結(jié)合目標(biāo)基因RNA而影響目標(biāo)基因的蛋白表達(dá)
（1）簡單驗證
A. 目標(biāo)基因m6A甲基化的驗證：MeRIP-RT-PCR
B. 檢測目標(biāo)基因的mRNA表達(dá)水平：RT-qPCR
C. 檢測目標(biāo)基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平：Western blot
（2）全局m6A甲基化干擾實驗（非靶向），驗證m6A甲基化書否真的影響目標(biāo)基因表達(dá)和細(xì)胞功能
A. m6A甲基化干擾：m6A writers/erasers的突變/敲降/敲除/過表達(dá)、m6A甲基化抑制劑
如環(huán)亮氨酸、m6A去甲基化抑制劑如FTO抑制劑FB23-2
B. 檢測m6A甲基化整體變化：m6A甲基化免疫熒光染色（定性）、m6A斑點雜交（定性）、比色法（定量）、質(zhì)譜法（定量）
C. 檢測目標(biāo)基因的m6A甲基化變化：MeRIP-qPCR
D. 檢測目標(biāo)基因的mRNA水平：RT-qPCR
E. 檢測目標(biāo)基因蛋白質(zhì)水平：Western blot
F. 檢測細(xì)胞功能/表型變化
FB23-2給藥后，大腦損傷組神經(jīng)功能缺陷評分顯著變差
（3）靶向目標(biāo)基因的甲基化/去甲基化實驗，檢測某區(qū)域m6A修飾是否真的影響目標(biāo)基因的表達(dá)
A. 目的基因m6A甲基化干擾細(xì)胞系的構(gòu)建：熒光素酶活性分析實驗（Luciferase activity assay）——構(gòu)建含甲基化/未甲基化m6A位點的目標(biāo)基因-熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞并表達(dá)。
B. 檢測目標(biāo)基因的m6A甲基化變化：MeRIP-qPCR
C. 檢測熒光素酶報告基因的mRNA表達(dá)水平：RT-qPCR
D. 檢測目標(biāo)基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平：Western blot
E. 檢測細(xì)胞功能受到的影響：免疫熒光顯微觀察、功能標(biāo)志物測定... ...
用于驗證目標(biāo)基因上m6A甲基化功能的雙熒光素酶報告系統(tǒng)
（4）研究目標(biāo)基因的m6A甲基化如何影響目標(biāo)基因表達(dá)
A. 檢測m6A是否通過影響目標(biāo)基因翻譯而影響蛋白質(zhì)水平：
Polysome profiling
Ribo-seq
通過對結(jié)合核糖體上的mRNA進(jìn)行定量，分析目標(biāo)基因的蛋白翻譯效率
通過對結(jié)合核糖體上的mRNA進(jìn)行定量，分析目標(biāo)基因的蛋白翻譯效率
Polysome Profiling方法舉例：
siMETTL3/14對目標(biāo)基因與與核糖體的結(jié)合造成影響，對內(nèi)參基因GAPDH無影響。
B. 研究m6A是否通過調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性和降解而影響目標(biāo)基因蛋白水平
研究m6A對目標(biāo)基因mRNA水平的影響
RT-qPCR
RNA-seq
C. 研究m6A是否通過調(diào)控RNA的出核（nuclear export）而影響目標(biāo)基因蛋白水平
裂解細(xì)胞，超速離心分離細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)，然后分別進(jìn)行RT-PCR實驗檢測細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中的mRNA水平
METTL3/14干擾后，采用RT-PCR檢測目標(biāo)基因在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中的mRNA水平是否受到影響（5）m6A修飾目標(biāo)基因的表達(dá)回復(fù)實驗
A. writers的突變/敲降/敲除實驗：
RT-PCR檢測目標(biāo)基因的mRNA水平變化
Western blot檢測目標(biāo)基因的蛋白水平變化
檢測目標(biāo)基因的功能
B. writers的突變/敲降/敲除后，目標(biāo)基因的過表達(dá)回復(fù)實驗：
檢測各項表型指數(shù)、細(xì)胞增殖、分化的回復(fù)情況
METTL3敲除后，靶基因Ezh2的蛋白表達(dá)受到影響。而靶基因Ezh2過表達(dá)回復(fù)實驗會消除METTL3敲除對細(xì)胞增殖分化的不利影響
（6）研究特定m6A Readers通過結(jié)合目標(biāo)基因RNA而影響目標(biāo)基因的蛋白表達(dá)
- 合理推測結(jié)合目標(biāo)基因的m6A Readers是哪一種
- Readers的突變/敲降/敲除/過表達(dá)實驗：
- 驗證靶基因的mRNA水平
- 的RIP-qPCR驗證Readers蛋白與靶基因mRNA的結(jié)合
YTHDF1引入突變后，檢測其假定靶基因的表達(dá)和與靶基因的結(jié)合是否受到影響
標(biāo)簽：
RNA甲基化
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