無(wú)菌是細(xì)胞治療的一項(xiàng)關(guān)鍵質(zhì)量屬性。由于細(xì)胞治療產(chǎn)品的微生物污染可能會(huì)導(dǎo)致接受者危及生命的感染，無(wú)菌檢查是任何細(xì)胞治療產(chǎn)品的放行檢測(cè)中的關(guān)鍵組成部分。

目前的藥典無(wú)菌檢查需要14天才能確定排除污染，這對(duì)于有效期短的細(xì)胞療法藥品來(lái)說(shuō)太長(zhǎng)了，特別是那些用于治療晚期病人的自體細(xì)胞療法藥品。因此，市場(chǎng)對(duì)不依賴于微生物生長(zhǎng)的快速檢測(cè)方法的需求與日俱增。

賽多利斯開(kāi)發(fā)出了一種由高效DNA提取方案組成的檢測(cè)系統(tǒng)：先用Microsart® 細(xì)菌提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，然后，用Microsart™ATMP細(xì)菌檢測(cè)試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR測(cè)定。

在本研究中，Microsart® ATMP細(xì)菌實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)試劑盒的穩(wěn)健性通過(guò)在三種不同的檢出限，分別是2xLOD₉₅、LOD₉₅ 和½ LOD₉₅ 條件下用產(chǎn)孢梭菌（ATCC 19404）加入DMEM+5%FBS來(lái)證明，由5名參與者進(jìn)行檢測(cè)，他們是來(lái)自生物制藥行業(yè)和醫(yī)院附屬實(shí)驗(yàn)室的代表。將樣本冷凍運(yùn)送給所有檢測(cè)參與者，以便在他們所在的檢測(cè)中心使用Microsart® 細(xì)菌提取試劑盒和Microsart® ATMP細(xì)菌檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

借助于貝塔測(cè)試，本研究的結(jié)果證明，基于實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的細(xì)菌污染快速檢測(cè)是一種穩(wěn)健且適用的方法，可有助于降低風(fēng)險(xiǎn)從而有益于患者安全。

材料和方法
每名貝塔測(cè)試參與者都收到了所需的試劑盒和耗材（參見(jiàn)表1）。

表1. 用于檢測(cè)的試劑盒和耗材
 

所需的實(shí)驗(yàn)室儀器和設(shè)備由參與者提供，如實(shí)時(shí)PCR 儀等。參與者未知的加標(biāo)樣本（參見(jiàn)表2）由賽多利斯提供。

表2. 用于貝塔測(cè)試的未知加標(biāo)樣本
 

所有貝塔測(cè)試參與者都遵守了以下步驟：

1. 將1ml NEC 分別移液至2個(gè)處理管（處理管在Microsart® 細(xì)菌提取試劑盒中）中，并標(biāo)記“NEC 1”和“NEC 2”。

2. 將950μl 基質(zhì)分別移液至管1至管8中（每管中已經(jīng)含有50μl 未知加標(biāo)樣本），然后用漩渦混勻器混合。

3. 根據(jù)Microsart® 細(xì)菌提取試劑盒檢測(cè)方案，提取所有10個(gè)樣本（2個(gè)NEC，8個(gè)未知）的DNA。

4. 根據(jù)Microsart® ATMP 細(xì)菌檢測(cè)試劑盒檢測(cè)方案，對(duì)PCR 進(jìn)行設(shè)置。

5. 重復(fù)分析DNA 提取物（DNA 提取和PCR 設(shè)置的樣本數(shù)量概述如表3所示）。

6. 對(duì)于數(shù)據(jù)分析，遵循使用了手冊(cè)中的說(shuō)明。
    

表3. DNA提取和PCR設(shè)置的樣本數(shù)量概述

結(jié)果
預(yù)期結(jié)果如表4所列。如果所有含有LOD₉₅ 和2x LOD₉₅ 濃度的產(chǎn)孢梭菌（ATCC 19404）的樣本均已檢測(cè)為陽(yáng)性，每名參與者的8個(gè)NEC 中至少有6個(gè)為陰性，每名參與者的2個(gè)PCR 對(duì)照都必須為陰性，且每名參與者的2個(gè)PCR 陽(yáng)性對(duì)照都為陽(yáng)性，則滿足可接受標(biāo)準(zhǔn)。
 

表4. 每名貝塔測(cè)試參與者的預(yù)期結(jié)果

討論
根據(jù)參與者們的報(bào)告結(jié)果，5名參與者中有4名正確分析了所有未知樣本。關(guān)于一名參與者未檢測(cè)出最高濃度的樣本而可以檢測(cè)較低的濃度，可以認(rèn)為這是由于操作錯(cuò)誤而不是由于Microsart® ATMP 細(xì)菌檢測(cè)試劑盒的靈敏度問(wèn)題造成的。所有實(shí)驗(yàn)室都將這些樣本正確地識(shí)別為陰性。

因此，每名參與者至少有6個(gè)陰性提取對(duì)照均為陰性，滿足可接受標(biāo)準(zhǔn)。1名參與者在一個(gè)PCR 無(wú)模板對(duì)照中檢測(cè)出一個(gè)陽(yáng)性信號(hào)。我們的結(jié)論是：最有可能的原因是移液失誤，因?yàn)樵搮⑴c者已經(jīng)按照預(yù)期檢出了所有其他樣本。

基于參與者都是未經(jīng)培訓(xùn)的用戶、僅由賽多利斯用戶說(shuō)明指導(dǎo)、使用各種不同的PCR儀、且大多沒(méi)有專用的無(wú)DNA 實(shí)驗(yàn)室條件，該結(jié)果依然證明了本次測(cè)定的實(shí)驗(yàn)室間精密度和穩(wěn)健性。

總結(jié)
綜上所述，使用專門設(shè)計(jì)的Microsart® 細(xì)菌提取試劑盒和Microsart® ATMP 細(xì)菌檢測(cè)試劑盒已被證明是一種快速、穩(wěn)健的細(xì)菌污染總數(shù)檢測(cè)工具。尤其是對(duì)時(shí)間要求敏感性較高的應(yīng)用中，如有效期短的產(chǎn)品（如ATMPs、CAR-T 細(xì)胞和其他細(xì)胞療法藥品）的質(zhì)量控制，它有助于降低風(fēng)險(xiǎn)，從而提高病人的安全性，因?yàn)樗�可以在病人治療前獲得質(zhì)量控制檢測(cè)結(jié)果。