表觀遺傳時(shí)鐘（甲基化年齡）在衰老和腫瘤中的作用
早在2018年，加州大學(xué)洛杉磯分校生物統(tǒng)計(jì)學(xué)家Steve Horvath研究發(fā)現(xiàn)：隨著年齡的增加，某些基因的甲基化增加了，而另一些基因的甲基化會(huì)減少，處于浮動(dòng)狀態(tài)。在此基礎(chǔ)上他設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了表觀遺傳時(shí)鐘（Epigenetic clock），即利用基因的甲基化圖譜來(lái)判斷生理年齡，且精確度高達(dá)98%。本期我們通過(guò)3篇研究論文說(shuō)說(shuō)表觀遺傳時(shí)鐘（或DNA甲基化年齡）的作用，它和衰老相關(guān)，也和癌癥高度相關(guān)。
01 小鼠：表觀遺傳時(shí)鐘與衰老
標(biāo)題：Tick tock, tick tock: Mouse culture and tissue aging captured by an epigenetic clock.
期刊：Aging Cell
影響因子:IF 9.304
發(fā)表時(shí)間：2022.01.25
技術(shù)平臺(tái)：RRBS
摘要：
衰老與DNA甲基化的動(dòng)態(tài)變化相關(guān)，盡管這種變化的前因后果尚不清楚，通過(guò)體外模型研究控制這些變化，可以從實(shí)驗(yàn)中大大提高揭示表觀遺傳衰老機(jī)制的能力。然而目前尚不清楚培養(yǎng)細(xì)胞引起的變化是否可以作為體內(nèi)衰老組織中觀察到的模型。為此作者對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs）傳代培養(yǎng)并通過(guò)簡(jiǎn)化代表性重亞硫酸鹽測(cè)序（reduced representation bisulfite sequencing，RRBS）評(píng)估每個(gè)階段的DNA甲基化水平變化。此外，作者開(kāi)發(fā)一種被稱(chēng)為“CultureAGE”的體外追蹤細(xì)胞衰老方法，檢測(cè)能否追蹤各種小鼠組織的生理衰老，以及抗衰老干預(yù)能否調(diào)控這種追蹤方法。結(jié)果顯示，隨著年齡的增長(zhǎng)，多個(gè)組織（肝、肺、腎、血液和脂肪）中CultureAGE值顯著增加。且通過(guò)對(duì)照驗(yàn)證CultureAGE值不是細(xì)胞衰老的標(biāo)志物，表明CultureAGE揭示了一種可以在體外誘導(dǎo)的獨(dú)特但漸進(jìn)的細(xì)胞衰老現(xiàn)象。此外研究還證明，當(dāng)MEFs重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）時(shí)，在熱量限制的動(dòng)物中表觀遺傳衰老速度較慢。富集和聚類(lèi)分析表明，EED和PcGs（Polycomb group）蛋白是翻譯culture aging表型中潛在的重要染色質(zhì)調(diào)控因子�？傊狙芯孔C實(shí)可以體外誘導(dǎo)生理相關(guān)衰老變化，并揭示表觀遺傳衰老機(jī)制。
實(shí)驗(yàn)方法：
在兩只雌性小鼠妊娠第12.5天提取分離MEF細(xì)胞。將細(xì)胞進(jìn)行分裂/傳代培養(yǎng)六次，每次傳代均進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)/共聚焦顯微鏡和RRBS測(cè)序。通過(guò)RRBS在三個(gè)生物重復(fù)的每次傳代中評(píng)估DNA甲基化變化。
圖1：在MEF中測(cè)定DNA甲基化CultureAGE值
（a）在常氧（20%O2）狀態(tài)下對(duì)MEF培養(yǎng)，直至細(xì)胞終末停滯狀態(tài)（細(xì)胞衰老），其復(fù)制能力逐漸降低。（b）RRBS測(cè)序的DNA甲基化數(shù)據(jù)中產(chǎn)生CultureAGE，隨后在衰老活體隊(duì)列中進(jìn)行生理相關(guān)性測(cè)試。
（c）紅色=MEF1細(xì)胞系，藍(lán)色=MEF2細(xì)胞系，綠色=MEF3細(xì)胞系重復(fù)驗(yàn)證。利用皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析法確定通路相關(guān)性和統(tǒng)計(jì)顯著性。
關(guān)鍵圖形：
CultureAGE表型獨(dú)立于細(xì)胞衰老表型，需要復(fù)制擴(kuò)增
聚類(lèi)分析證實(shí)culture aging存在于生理環(huán)境中，并強(qiáng)調(diào)PcG蛋白是重要的culture aging調(diào)控因子
02 F344大鼠：表觀遺傳時(shí)鐘與大顆粒淋巴細(xì)胞白血病
標(biāo)題：Impact of Large Granular Lymphocyte Leukemia on Blood DNA Methylation and Epigenetic Clock Modeling in Fischer 344 Rats
期刊：J Gerontol A Biol Sci Med Sci
影響因子：IF 6.053
發(fā)表時(shí)間：2021.10.28
技術(shù)平臺(tái)：RRBS
摘要：
特定CpG位點(diǎn)的甲基化年齡依賴(lài)性差異已在“表觀遺傳時(shí)鐘”公式中用以預(yù)測(cè)年齡。表觀遺傳年齡與實(shí)際年齡的偏差情況與不良健康結(jié)果相關(guān)，有助于了解健康狀況。在大多數(shù)情況下，表觀遺傳時(shí)鐘通過(guò)從循環(huán)血細(xì)胞中提取DNA進(jìn)行甲基化水平評(píng)估。然而，表觀遺傳時(shí)鐘對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的影響尚不清楚。本研究使用常發(fā)生大顆粒淋巴細(xì)胞白血�。↙GLL）的61只17-27個(gè)月大的Fischer 344（F344）大鼠為樣本，檢測(cè)在27只大鼠的脾臟和肝臟中發(fā)現(xiàn)明確的LGLL病理學(xué)標(biāo)記。作者利用覆蓋300萬(wàn)個(gè)CpG位點(diǎn)的簡(jiǎn)化甲基化測(cè)序（RRBS）來(lái)評(píng)估DNA甲基化。盡管LGLL廣泛增加DNA甲基化的變異性，但并沒(méi)有改變表觀遺傳衰老狀態(tài)。將LGLL大鼠納入時(shí)鐘訓(xùn)練集，結(jié)果顯著改變了121個(gè)常用CPG位點(diǎn)中的83個(gè)預(yù)測(cè)因子。此外在包含LGLL的大鼠樣本上的訓(xùn)練模型比不含LGLL的訓(xùn)練模型具有更大的絕對(duì)年齡差（增加39%；p<0.0001）。表明衰老和LGLL的表觀遺傳學(xué)信號(hào)不同，因此LGLL評(píng)估不是F344大鼠中表觀遺傳年齡的必需有效測(cè)定，不過(guò)表觀遺傳時(shí)鐘公式的精度和結(jié)構(gòu)可能會(huì)受到訓(xùn)練集中腫瘤造血細(xì)胞的影響。
實(shí)驗(yàn)方法：
該研究共使用162只雄性F344 CDF大鼠（1-27個(gè)月，每個(gè)月齡6只）。將大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，可隨意攝入標(biāo)準(zhǔn)的室內(nèi)食物和水，并保持12小時(shí)開(kāi)燈-12小時(shí)關(guān)燈循環(huán)。評(píng)估LGLL的大鼠在抽血后4周內(nèi)進(jìn)行安樂(lè)死，解剖內(nèi)部器官并儲(chǔ)存在中性緩沖的10%福爾馬林中用于隨后的病理學(xué)分析。此前研究表明在18月齡之前存在 LGLL 極為罕見(jiàn)，因此本研究只評(píng)估17-27月齡大鼠 (n = 61) 的 LGLL 病理學(xué)，并評(píng)估六只 6月齡大鼠和六只 12月齡大鼠的脾臟和肝臟病理學(xué)作為陰性對(duì)照。提取大鼠血液DNA進(jìn)行簡(jiǎn)化甲基化測(cè)序（RRBS）和高性能統(tǒng)計(jì)分析。
結(jié)果：
LGLL病理學(xué)
LGLL相關(guān)的DNA甲基化水平變化
LGLL對(duì)表觀遺傳鐘的影響
03 人樣本：乳腺癌與復(fù)制相關(guān)的表觀遺傳時(shí)鐘
標(biāo)題：DNA methylation landscapes of 1538 breast cancers reveal a replication-linked clock, epigenomic instability and cis-regulation.
期刊：nature communications
影響因子: IF 14.919
發(fā)表時(shí)間：2021.09.13
技術(shù)平臺(tái)：RRBS
摘要：
DNA甲基化在癌癥中是異常的，但這種表觀遺傳學(xué)變化的動(dòng)力學(xué)作用、調(diào)控作用和臨床意義仍然知之甚少。
METABRIC隊(duì)列中包含了2000多個(gè)乳腺癌樣本，這些樣本此前已在臨床、遺傳和轉(zhuǎn)錄方面進(jìn)行了廣泛表征。本文作者使用RRBS測(cè)序分析技術(shù)對(duì)其DNA甲基化狀態(tài)進(jìn)行研究。來(lái)自METABRIC隊(duì)列的1538例乳腺癌組織和244個(gè)相鄰正常乳腺組織的簡(jiǎn)化甲基化測(cè)序（RRBS）譜，在豐富的基因組、轉(zhuǎn)錄組和臨床數(shù)據(jù)背景下對(duì)DNA甲基化進(jìn)行深度分析。來(lái)自免疫和間質(zhì)標(biāo)記物的腫瘤DNA甲基化狀態(tài)被反褶積（deconvoluted），從而導(dǎo)致在非CpG位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)與全基因組甲基化丟失的腫瘤復(fù)制相關(guān)時(shí)鐘（replication-linked clock）。出乎意料的是，在大部分CpG區(qū)域甲基化遵循兩個(gè)獨(dú)立于復(fù)制的獲得（MG）或丟失（ML）過(guò)程，稱(chēng)之為表觀基因組不穩(wěn)定性，表觀基因組不穩(wěn)定性與腫瘤分級(jí)/分期、TP53突變和較差預(yù)后相關(guān)。另外，研究人員在數(shù)百個(gè)啟動(dòng)子和數(shù)千個(gè)遠(yuǎn)端元件中發(fā)現(xiàn)了順式特異性甲基化（cis-specific methylation）和表達(dá)相關(guān)，包括一些已知的腫瘤抑制因子和致癌基因，證明了數(shù)百個(gè)啟動(dòng)子和數(shù)千個(gè)遠(yuǎn)端元件中的甲基化水平和特異性順式作用下的基因表達(dá)相關(guān)，突出了全基因組甲基化水平變化在腫瘤轉(zhuǎn)錄改變中的重要作用，包括典型的BRCA1高甲基化效應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)方法：
從METABRIC數(shù)據(jù)庫(kù)中選取1538個(gè)原發(fā)性乳腺癌組織樣本和244個(gè)相鄰組織的正常樣本，共1782個(gè)樣本進(jìn)行簡(jiǎn)化DNA甲基化測(cè)序分析（RRBS），并建立導(dǎo)致乳腺癌DNA甲基化過(guò)程的多因素統(tǒng)一模型。
結(jié)果：
乳腺癌與復(fù)制相關(guān)的DNA甲基化時(shí)鐘過(guò)程相關(guān)
1.METABRIC 隊(duì)列的甲基化分析
從METABRIC隊(duì)列中選取1538個(gè)原發(fā)性乳腺癌組織樣本和244個(gè)相鄰組織的正常樣本，利用可獲得的臨床、基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)分析甲基化過(guò)程（圖1a），研究人員利用RRBS測(cè)序方法對(duì)這1782個(gè)樣本以30.4B reads來(lái)覆蓋廣泛的基因組分布，有助于分析全基因組甲基化變化趨勢(shì)及調(diào)控元件和啟動(dòng)子的甲基化變化。RRBS測(cè)序方法使93%的樣本被超過(guò)1 M CpG位點(diǎn)的10個(gè)以上reads覆蓋(圖1b)，9%的reads被映射到真正的啟動(dòng)子區(qū)域（圖1c）,75%的啟動(dòng)子區(qū)域平均覆蓋超過(guò)20個(gè)reads（平均覆蓋246個(gè)），有助于下游的定量分析（圖1d）。
2.乳腺癌甲基化的分層建模
以METABRIC數(shù)據(jù)庫(kù)為模型，研究人員開(kāi)發(fā)了一種半監(jiān)督算法（Methylayer），用于腫瘤甲基化動(dòng)力學(xué)的分層建模（圖1e）。Methylayer的基本原理依賴(lài)于基因表達(dá)、遺傳學(xué)和臨床信息的整合，計(jì)算混雜因素（腫瘤微環(huán)境[TME]效應(yīng)），以此推斷可隨機(jī)影響全基因組甲基化變化趨勢(shì)，Methylayer可以強(qiáng)有力地篩選表觀遺傳順式調(diào)控的候選基因，并得出預(yù)后指標(biāo)。將Methylayer分別應(yīng)用于METABRIC隊(duì)列的ER+和ER-腫瘤樣本，并比較兩類(lèi)腫瘤樣本的動(dòng)力學(xué)。
數(shù)據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因表達(dá)的整合使Methyllayer將TME效應(yīng)識(shí)別為主要數(shù)據(jù)混雜因素，從而促進(jìn)從腫瘤活檢中獲得的甲基化圖譜多樣化（圖1f）。該算法在基因表達(dá)和啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的相互關(guān)聯(lián)中檢測(cè)到一個(gè)強(qiáng)大的免疫標(biāo)記，即TME標(biāo)記與腫瘤分級(jí)相關(guān)(圖1g)，并通過(guò)獨(dú)立的反褶積表達(dá)譜和病理指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證。在對(duì)TME標(biāo)記進(jìn)行推斷之后，研究人員應(yīng)用了一種新的K-nn歸一化算法(K-nn normalization algorithm Methods，圖1h)，該算法在推斷下游腫瘤甲基化區(qū)域時(shí)，驗(yàn)證了Methyllayer顯著降低了TME偏差。
3. 復(fù)制相關(guān)的甲基化時(shí)鐘過(guò)程與腫瘤中甲基化丟失相關(guān)
與對(duì)照組相比，基于TME標(biāo)準(zhǔn)甲基化的Methyllayer聚類(lèi)在腫瘤樣本中鑒定出一組高度相關(guān)的CpG區(qū)域 (圖1i)，這一甲基化區(qū)域與腫瘤分級(jí)不相關(guān)(圖1j)，將其標(biāo)記為時(shí)鐘層（clock layer），盡管與啟動(dòng)子相關(guān)的遠(yuǎn)端定位相關(guān)，但時(shí)鐘層CpG顯示出較低的CpG含量(圖1k),因此在推定的調(diào)控元件（基于組蛋白修飾）中代表性不足。
基因組通過(guò)定義早期和晚期復(fù)制域的調(diào)控過(guò)程在S期復(fù)制。有趣的是，在S晚期復(fù)制域中，時(shí)鐘層的腫瘤甲基化減少更為強(qiáng)烈（圖1l,m）。這與此前研究一致，表明衰老和癌癥中DNA甲基化的丟失可能與復(fù)制過(guò)程中相關(guān)的甲基化異常積累（“epi-mutations”,表突變）相關(guān)。篩選跨METABRIC的基因表達(dá)特征并未發(fā)現(xiàn)與甲基化時(shí)鐘層相關(guān)的常規(guī)轉(zhuǎn)錄程序�？傊@些數(shù)據(jù)共同表明癌癥中甲基化丟失時(shí)鐘的動(dòng)力學(xué)與基因組復(fù)制過(guò)程密切相關(guān)。
參考文獻(xiàn)：
DOI:10.1111/acel.13553
DOI:10.1093/gerona/glab328
DOI:10.1038/s41467-021-25661-w
01 小鼠：表觀遺傳時(shí)鐘與衰老
標(biāo)題：Tick tock, tick tock: Mouse culture and tissue aging captured by an epigenetic clock.
期刊：Aging Cell
影響因子:IF 9.304
發(fā)表時(shí)間：2022.01.25
技術(shù)平臺(tái)：RRBS
摘要：
衰老與DNA甲基化的動(dòng)態(tài)變化相關(guān)，盡管這種變化的前因后果尚不清楚，通過(guò)體外模型研究控制這些變化，可以從實(shí)驗(yàn)中大大提高揭示表觀遺傳衰老機(jī)制的能力。然而目前尚不清楚培養(yǎng)細(xì)胞引起的變化是否可以作為體內(nèi)衰老組織中觀察到的模型。為此作者對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs）傳代培養(yǎng)并通過(guò)簡(jiǎn)化代表性重亞硫酸鹽測(cè)序（reduced representation bisulfite sequencing，RRBS）評(píng)估每個(gè)階段的DNA甲基化水平變化。此外，作者開(kāi)發(fā)一種被稱(chēng)為“CultureAGE”的體外追蹤細(xì)胞衰老方法，檢測(cè)能否追蹤各種小鼠組織的生理衰老，以及抗衰老干預(yù)能否調(diào)控這種追蹤方法。結(jié)果顯示，隨著年齡的增長(zhǎng)，多個(gè)組織（肝、肺、腎、血液和脂肪）中CultureAGE值顯著增加。且通過(guò)對(duì)照驗(yàn)證CultureAGE值不是細(xì)胞衰老的標(biāo)志物，表明CultureAGE揭示了一種可以在體外誘導(dǎo)的獨(dú)特但漸進(jìn)的細(xì)胞衰老現(xiàn)象。此外研究還證明，當(dāng)MEFs重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）時(shí)，在熱量限制的動(dòng)物中表觀遺傳衰老速度較慢。富集和聚類(lèi)分析表明，EED和PcGs（Polycomb group）蛋白是翻譯culture aging表型中潛在的重要染色質(zhì)調(diào)控因子�？傊狙芯孔C實(shí)可以體外誘導(dǎo)生理相關(guān)衰老變化，并揭示表觀遺傳衰老機(jī)制。
實(shí)驗(yàn)方法：
在兩只雌性小鼠妊娠第12.5天提取分離MEF細(xì)胞。將細(xì)胞進(jìn)行分裂/傳代培養(yǎng)六次，每次傳代均進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)/共聚焦顯微鏡和RRBS測(cè)序。通過(guò)RRBS在三個(gè)生物重復(fù)的每次傳代中評(píng)估DNA甲基化變化。
圖1：在MEF中測(cè)定DNA甲基化CultureAGE值
（c）紅色=MEF1細(xì)胞系，藍(lán)色=MEF2細(xì)胞系，綠色=MEF3細(xì)胞系重復(fù)驗(yàn)證。利用皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析法確定通路相關(guān)性和統(tǒng)計(jì)顯著性。
關(guān)鍵圖形：
CultureAGE表型獨(dú)立于細(xì)胞衰老表型，需要復(fù)制擴(kuò)增
通過(guò)CultureAGE測(cè)定多組織生理衰老模式
CultureAGE預(yù)測(cè)熱量限制小鼠和重編程的MEF細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)
02 F344大鼠：表觀遺傳時(shí)鐘與大顆粒淋巴細(xì)胞白血病
標(biāo)題：Impact of Large Granular Lymphocyte Leukemia on Blood DNA Methylation and Epigenetic Clock Modeling in Fischer 344 Rats
期刊：J Gerontol A Biol Sci Med Sci
影響因子：IF 6.053
發(fā)表時(shí)間：2021.10.28
技術(shù)平臺(tái)：RRBS
摘要：
特定CpG位點(diǎn)的甲基化年齡依賴(lài)性差異已在“表觀遺傳時(shí)鐘”公式中用以預(yù)測(cè)年齡。表觀遺傳年齡與實(shí)際年齡的偏差情況與不良健康結(jié)果相關(guān)，有助于了解健康狀況。在大多數(shù)情況下，表觀遺傳時(shí)鐘通過(guò)從循環(huán)血細(xì)胞中提取DNA進(jìn)行甲基化水平評(píng)估。然而，表觀遺傳時(shí)鐘對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的影響尚不清楚。本研究使用常發(fā)生大顆粒淋巴細(xì)胞白血�。↙GLL）的61只17-27個(gè)月大的Fischer 344（F344）大鼠為樣本，檢測(cè)在27只大鼠的脾臟和肝臟中發(fā)現(xiàn)明確的LGLL病理學(xué)標(biāo)記。作者利用覆蓋300萬(wàn)個(gè)CpG位點(diǎn)的簡(jiǎn)化甲基化測(cè)序（RRBS）來(lái)評(píng)估DNA甲基化。盡管LGLL廣泛增加DNA甲基化的變異性，但并沒(méi)有改變表觀遺傳衰老狀態(tài)。將LGLL大鼠納入時(shí)鐘訓(xùn)練集，結(jié)果顯著改變了121個(gè)常用CPG位點(diǎn)中的83個(gè)預(yù)測(cè)因子。此外在包含LGLL的大鼠樣本上的訓(xùn)練模型比不含LGLL的訓(xùn)練模型具有更大的絕對(duì)年齡差（增加39%；p<0.0001）。表明衰老和LGLL的表觀遺傳學(xué)信號(hào)不同，因此LGLL評(píng)估不是F344大鼠中表觀遺傳年齡的必需有效測(cè)定，不過(guò)表觀遺傳時(shí)鐘公式的精度和結(jié)構(gòu)可能會(huì)受到訓(xùn)練集中腫瘤造血細(xì)胞的影響。
實(shí)驗(yàn)方法：
該研究共使用162只雄性F344 CDF大鼠（1-27個(gè)月，每個(gè)月齡6只）。將大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，可隨意攝入標(biāo)準(zhǔn)的室內(nèi)食物和水，并保持12小時(shí)開(kāi)燈-12小時(shí)關(guān)燈循環(huán)。評(píng)估LGLL的大鼠在抽血后4周內(nèi)進(jìn)行安樂(lè)死，解剖內(nèi)部器官并儲(chǔ)存在中性緩沖的10%福爾馬林中用于隨后的病理學(xué)分析。此前研究表明在18月齡之前存在 LGLL 極為罕見(jiàn)，因此本研究只評(píng)估17-27月齡大鼠 (n = 61) 的 LGLL 病理學(xué)，并評(píng)估六只 6月齡大鼠和六只 12月齡大鼠的脾臟和肝臟病理學(xué)作為陰性對(duì)照。提取大鼠血液DNA進(jìn)行簡(jiǎn)化甲基化測(cè)序（RRBS）和高性能統(tǒng)計(jì)分析。
結(jié)果：
LGLL病理學(xué)
按年齡劃分的大鼠 LGLL 患病率
LGLL相關(guān)的DNA甲基化水平變化
LGLL大鼠CpG甲基化的變異性增加
LGLL對(duì)表觀遺傳鐘的影響
LGLL降低了表觀遺傳時(shí)鐘精度，不會(huì)加速表觀遺傳衰老
LGLL影響表觀遺傳時(shí)鐘生成過(guò)程中的預(yù)測(cè)因子選擇
03 人樣本：乳腺癌與復(fù)制相關(guān)的表觀遺傳時(shí)鐘
標(biāo)題：DNA methylation landscapes of 1538 breast cancers reveal a replication-linked clock, epigenomic instability and cis-regulation.
期刊：nature communications
影響因子: IF 14.919
發(fā)表時(shí)間：2021.09.13
技術(shù)平臺(tái)：RRBS
摘要：
DNA甲基化在癌癥中是異常的，但這種表觀遺傳學(xué)變化的動(dòng)力學(xué)作用、調(diào)控作用和臨床意義仍然知之甚少。
METABRIC隊(duì)列中包含了2000多個(gè)乳腺癌樣本，這些樣本此前已在臨床、遺傳和轉(zhuǎn)錄方面進(jìn)行了廣泛表征。本文作者使用RRBS測(cè)序分析技術(shù)對(duì)其DNA甲基化狀態(tài)進(jìn)行研究。來(lái)自METABRIC隊(duì)列的1538例乳腺癌組織和244個(gè)相鄰正常乳腺組織的簡(jiǎn)化甲基化測(cè)序（RRBS）譜，在豐富的基因組、轉(zhuǎn)錄組和臨床數(shù)據(jù)背景下對(duì)DNA甲基化進(jìn)行深度分析。來(lái)自免疫和間質(zhì)標(biāo)記物的腫瘤DNA甲基化狀態(tài)被反褶積（deconvoluted），從而導(dǎo)致在非CpG位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)與全基因組甲基化丟失的腫瘤復(fù)制相關(guān)時(shí)鐘（replication-linked clock）。出乎意料的是，在大部分CpG區(qū)域甲基化遵循兩個(gè)獨(dú)立于復(fù)制的獲得（MG）或丟失（ML）過(guò)程，稱(chēng)之為表觀基因組不穩(wěn)定性，表觀基因組不穩(wěn)定性與腫瘤分級(jí)/分期、TP53突變和較差預(yù)后相關(guān)。另外，研究人員在數(shù)百個(gè)啟動(dòng)子和數(shù)千個(gè)遠(yuǎn)端元件中發(fā)現(xiàn)了順式特異性甲基化（cis-specific methylation）和表達(dá)相關(guān)，包括一些已知的腫瘤抑制因子和致癌基因，證明了數(shù)百個(gè)啟動(dòng)子和數(shù)千個(gè)遠(yuǎn)端元件中的甲基化水平和特異性順式作用下的基因表達(dá)相關(guān)，突出了全基因組甲基化水平變化在腫瘤轉(zhuǎn)錄改變中的重要作用，包括典型的BRCA1高甲基化效應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)方法：
從METABRIC數(shù)據(jù)庫(kù)中選取1538個(gè)原發(fā)性乳腺癌組織樣本和244個(gè)相鄰組織的正常樣本，共1782個(gè)樣本進(jìn)行簡(jiǎn)化DNA甲基化測(cè)序分析（RRBS），并建立導(dǎo)致乳腺癌DNA甲基化過(guò)程的多因素統(tǒng)一模型。
結(jié)果：
乳腺癌與復(fù)制相關(guān)的DNA甲基化時(shí)鐘過(guò)程相關(guān)
1.METABRIC 隊(duì)列的甲基化分析
從METABRIC隊(duì)列中選取1538個(gè)原發(fā)性乳腺癌組織樣本和244個(gè)相鄰組織的正常樣本，利用可獲得的臨床、基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)分析甲基化過(guò)程（圖1a），研究人員利用RRBS測(cè)序方法對(duì)這1782個(gè)樣本以30.4B reads來(lái)覆蓋廣泛的基因組分布，有助于分析全基因組甲基化變化趨勢(shì)及調(diào)控元件和啟動(dòng)子的甲基化變化。RRBS測(cè)序方法使93%的樣本被超過(guò)1 M CpG位點(diǎn)的10個(gè)以上reads覆蓋(圖1b)，9%的reads被映射到真正的啟動(dòng)子區(qū)域（圖1c）,75%的啟動(dòng)子區(qū)域平均覆蓋超過(guò)20個(gè)reads（平均覆蓋246個(gè)），有助于下游的定量分析（圖1d）。
2.乳腺癌甲基化的分層建模
以METABRIC數(shù)據(jù)庫(kù)為模型，研究人員開(kāi)發(fā)了一種半監(jiān)督算法（Methylayer），用于腫瘤甲基化動(dòng)力學(xué)的分層建模（圖1e）。Methylayer的基本原理依賴(lài)于基因表達(dá)、遺傳學(xué)和臨床信息的整合，計(jì)算混雜因素（腫瘤微環(huán)境[TME]效應(yīng)），以此推斷可隨機(jī)影響全基因組甲基化變化趨勢(shì)，Methylayer可以強(qiáng)有力地篩選表觀遺傳順式調(diào)控的候選基因，并得出預(yù)后指標(biāo)。將Methylayer分別應(yīng)用于METABRIC隊(duì)列的ER+和ER-腫瘤樣本，并比較兩類(lèi)腫瘤樣本的動(dòng)力學(xué)。
數(shù)據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因表達(dá)的整合使Methyllayer將TME效應(yīng)識(shí)別為主要數(shù)據(jù)混雜因素，從而促進(jìn)從腫瘤活檢中獲得的甲基化圖譜多樣化（圖1f）。該算法在基因表達(dá)和啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的相互關(guān)聯(lián)中檢測(cè)到一個(gè)強(qiáng)大的免疫標(biāo)記，即TME標(biāo)記與腫瘤分級(jí)相關(guān)(圖1g)，并通過(guò)獨(dú)立的反褶積表達(dá)譜和病理指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證。在對(duì)TME標(biāo)記進(jìn)行推斷之后，研究人員應(yīng)用了一種新的K-nn歸一化算法(K-nn normalization algorithm Methods，圖1h)，該算法在推斷下游腫瘤甲基化區(qū)域時(shí)，驗(yàn)證了Methyllayer顯著降低了TME偏差。
3. 復(fù)制相關(guān)的甲基化時(shí)鐘過(guò)程與腫瘤中甲基化丟失相關(guān)
與對(duì)照組相比，基于TME標(biāo)準(zhǔn)甲基化的Methyllayer聚類(lèi)在腫瘤樣本中鑒定出一組高度相關(guān)的CpG區(qū)域 (圖1i)，這一甲基化區(qū)域與腫瘤分級(jí)不相關(guān)(圖1j)，將其標(biāo)記為時(shí)鐘層（clock layer），盡管與啟動(dòng)子相關(guān)的遠(yuǎn)端定位相關(guān)，但時(shí)鐘層CpG顯示出較低的CpG含量(圖1k),因此在推定的調(diào)控元件（基于組蛋白修飾）中代表性不足。
基因組通過(guò)定義早期和晚期復(fù)制域的調(diào)控過(guò)程在S期復(fù)制。有趣的是，在S晚期復(fù)制域中，時(shí)鐘層的腫瘤甲基化減少更為強(qiáng)烈（圖1l,m）。這與此前研究一致，表明衰老和癌癥中DNA甲基化的丟失可能與復(fù)制過(guò)程中相關(guān)的甲基化異常積累（“epi-mutations”,表突變）相關(guān)。篩選跨METABRIC的基因表達(dá)特征并未發(fā)現(xiàn)與甲基化時(shí)鐘層相關(guān)的常規(guī)轉(zhuǎn)錄程序�？傊@些數(shù)據(jù)共同表明癌癥中甲基化丟失時(shí)鐘的動(dòng)力學(xué)與基因組復(fù)制過(guò)程密切相關(guān)。
圖: 在 METABRIC 隊(duì)列中解剖腫瘤、免疫學(xué)和 CAF 甲基化
參考文獻(xiàn)：
DOI:10.1111/acel.13553
DOI:10.1093/gerona/glab328
DOI:10.1038/s41467-021-25661-w
標(biāo)簽：
表觀遺傳時(shí)鐘
DNA甲基化
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