從mRNA到全轉錄組（mRNA+lncRNA+tRNA）m5C單堿基分辨檢測的介紹
m5C是RNA百余種修飾中研究較多的一種。m5C存在于tRNA上時，可以對翻譯進行調節(jié)；存在于rRNA上時，可以對核糖體的生物合成進行質控；存在于mRNA上時，則可以影響mRNA的結構、穩(wěn)定性及翻譯過程。RNA甲基化（m5C）與人類疾病密切相關，其功能涉及調控干細胞應激、細胞毒性應激、mRNA出核和植物細胞發(fā)育及基因表達等方面。
RNA-BS-seq（RNA-Bisulfite-sequencing）是一種檢測m5C的強有力技術。該技術利用重亞硫酸鹽處理RNA，使RNA上沒有發(fā)生修飾的C被轉化為U，而發(fā)生m5C修飾的C堿基則保持為C。經(jīng)PCR處理后，U轉變成T，這樣便將m5C與C區(qū)分開來。
研究案例
一、斑馬魚：m5C修飾在生理和病理進程中的重要調控作用
2019年8月，在Molecular Cell（17.97）發(fā)表的RNA 5-methylcytosine facilitates maternal-to-zygotic transition through preventing maternal mRNA decay文獻，研究了5-甲基胞嘧啶（m5C）如何參與調控母源mRNA穩(wěn)定性維持，發(fā)現(xiàn)m5C通過新結合蛋白Ybx1調控母源mRNA的穩(wěn)定性，進而調控斑馬魚母源-合子轉換（maternal-to-zygotic transition, MZT）及早期胚胎發(fā)育進程。通過繪制斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中RNA m5C甲基化圖譜，發(fā)現(xiàn)在母源-合子轉換過程中，m5C修飾的母源mRNA比未修飾的mRNA更穩(wěn)定。研究結果揭示：m5C修飾通過其結合蛋白Ybx1招募Pabpc1a維持母源mRNA穩(wěn)定性從而保證母源-合子轉換有序機制的發(fā)現(xiàn)，進一步證明其在調控重要生理和病理進程中的重要作用。
二、腫瘤：單堿基分辨率下分析人類膀胱尿路上皮癌(UCB)樣本中mRNA的m5C修飾
2019年，發(fā)表在Nature Cell Biology（IF: 28.824）上的5-methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs的文章，通過單堿基分辨，分析人類膀胱尿路上皮癌(UCB)樣本中mRNA的5甲基化胞嘧啶（m5C）修飾，鑒定出大量的癌基因mRNA攜帶高甲基化m5C修飾位點，并且高甲基化修飾基因在UCB樣本中呈現(xiàn)高表達。此外證明，YBX1可以特異性的識別m5C位點（Reader），YBX1通過募集ELAVL1蛋白維持靶向mRNA的穩(wěn)定性。此外發(fā)現(xiàn)，NSUN2和YBX1通過結合HDGF基因3’端非編碼區(qū)域的m5C位點驅動UCB的發(fā)病機制。本文揭示了m5C mRNA修飾對癌基因激活調控的新機制，也為不同腫瘤研究提供了新思路和潛在的治療策略。
三、哺乳動物：m5C修飾在mRNA出核和轉錄后調控中發(fā)揮重要作用
2017年，發(fā)表在Cell Research（IF: 25.617） 上，題為5-methylcytosine promotes mRNA export — NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader的研究發(fā)現(xiàn)，m5C修飾在富含CG的區(qū)域和翻譯起始位點下游的區(qū)域富集，在哺乳動物轉錄組中具有保守的、組織特異性的和動態(tài)的特征。此外，mRNA中m5C的形成主要是由RNA甲基轉移酶NSUN2催化的，且m5C在體內是由mRNA運輸因子ALYREF特異性識別。NSUN2調節(jié)ALYREF的核-質穿梭、RNA結合親和力和相關mRNA的出核。該研究提供了哺乳動物轉錄組的m5C的全面概況，并表明m5C修飾在mRNAc出核和轉錄后調控中發(fā)揮重要作用。
四、人細胞：重亞硫酸鹽處理結合高通量NGS策略，單堿基分辨率檢測(h)m5C修飾分布
2021年，發(fā)表在RNA Biology（IF: 4.652）上，題為Bisulphite miRNA-seq reveals widespread CpG and non-CpG 5-(hydroxy)methyl-Cytosine in human microRNAs文章，通過重亞硫酸鹽處理結合高通量NGS策略，以單核苷酸分辨率系統(tǒng)地分析miRNAs中的(h)m5C，即BS-miRNA-seq，單核苷酸分辨率系統(tǒng)地檢測了人類細胞系和人外周血單核細胞(PBMC)中miRNAs上的(h)m5C修飾，并通過開發(fā)的專用的分析流程(MAmBA)分析了樣本中的(h)m5C甲基化圖譜，發(fā)現(xiàn)(h)m5C是人miRNAs中廣泛存在的修飾，并不局限于CG序列，并且通過m5C和hm5C的抗體免疫沉淀驗證了實驗結果，也首次表明了人類miRNA包含hm5C修飾。
（詳細解讀：BS-miRNA-seq技術發(fā)現(xiàn)人類microRNA中CpG和非CpG上的(h)m5C修飾）
參考文獻：
Yang Y, et al.RNA 5-Methylcytosine Facilitates the Maternal-to-Zygotic Transition by Preventing Maternal mRNA Decay. Mol Cell. 2019 Sep 19;75(6):1188-1202.e11.
Chen X, et al.5-methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs. Nat Cell Biol. 2019 Aug;21(8):978-990.
Yang X, et al.5-methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Res. 2017 May;27(5):606-625.
Carissimi C, et al.Bisulphite miRNA-seq reveals widespread CpG and non-CpG 5-(hydroxy)methyl-Cytosine in human microRNAs. RNA Biol. 2021 Dec;18(12):2226-2235.
RNA-BS-seq（RNA-Bisulfite-sequencing）是一種檢測m5C的強有力技術。該技術利用重亞硫酸鹽處理RNA，使RNA上沒有發(fā)生修飾的C被轉化為U，而發(fā)生m5C修飾的C堿基則保持為C。經(jīng)PCR處理后，U轉變成T，這樣便將m5C與C區(qū)分開來。
研究案例
一、斑馬魚：m5C修飾在生理和病理進程中的重要調控作用
2019年8月，在Molecular Cell（17.97）發(fā)表的RNA 5-methylcytosine facilitates maternal-to-zygotic transition through preventing maternal mRNA decay文獻，研究了5-甲基胞嘧啶（m5C）如何參與調控母源mRNA穩(wěn)定性維持，發(fā)現(xiàn)m5C通過新結合蛋白Ybx1調控母源mRNA的穩(wěn)定性，進而調控斑馬魚母源-合子轉換（maternal-to-zygotic transition, MZT）及早期胚胎發(fā)育進程。通過繪制斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中RNA m5C甲基化圖譜，發(fā)現(xiàn)在母源-合子轉換過程中，m5C修飾的母源mRNA比未修飾的mRNA更穩(wěn)定。研究結果揭示：m5C修飾通過其結合蛋白Ybx1招募Pabpc1a維持母源mRNA穩(wěn)定性從而保證母源-合子轉換有序機制的發(fā)現(xiàn)，進一步證明其在調控重要生理和病理進程中的重要作用。
二、腫瘤：單堿基分辨率下分析人類膀胱尿路上皮癌(UCB)樣本中mRNA的m5C修飾
2019年，發(fā)表在Nature Cell Biology（IF: 28.824）上的5-methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs的文章，通過單堿基分辨，分析人類膀胱尿路上皮癌(UCB)樣本中mRNA的5甲基化胞嘧啶（m5C）修飾，鑒定出大量的癌基因mRNA攜帶高甲基化m5C修飾位點，并且高甲基化修飾基因在UCB樣本中呈現(xiàn)高表達。此外證明，YBX1可以特異性的識別m5C位點（Reader），YBX1通過募集ELAVL1蛋白維持靶向mRNA的穩(wěn)定性。此外發(fā)現(xiàn)，NSUN2和YBX1通過結合HDGF基因3’端非編碼區(qū)域的m5C位點驅動UCB的發(fā)病機制。本文揭示了m5C mRNA修飾對癌基因激活調控的新機制，也為不同腫瘤研究提供了新思路和潛在的治療策略。
三、哺乳動物：m5C修飾在mRNA出核和轉錄后調控中發(fā)揮重要作用
2017年，發(fā)表在Cell Research（IF: 25.617） 上，題為5-methylcytosine promotes mRNA export — NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader的研究發(fā)現(xiàn)，m5C修飾在富含CG的區(qū)域和翻譯起始位點下游的區(qū)域富集，在哺乳動物轉錄組中具有保守的、組織特異性的和動態(tài)的特征。此外，mRNA中m5C的形成主要是由RNA甲基轉移酶NSUN2催化的，且m5C在體內是由mRNA運輸因子ALYREF特異性識別。NSUN2調節(jié)ALYREF的核-質穿梭、RNA結合親和力和相關mRNA的出核。該研究提供了哺乳動物轉錄組的m5C的全面概況，并表明m5C修飾在mRNAc出核和轉錄后調控中發(fā)揮重要作用。
四、人細胞：重亞硫酸鹽處理結合高通量NGS策略，單堿基分辨率檢測(h)m5C修飾分布
2021年，發(fā)表在RNA Biology（IF: 4.652）上，題為Bisulphite miRNA-seq reveals widespread CpG and non-CpG 5-(hydroxy)methyl-Cytosine in human microRNAs文章，通過重亞硫酸鹽處理結合高通量NGS策略，以單核苷酸分辨率系統(tǒng)地分析miRNAs中的(h)m5C，即BS-miRNA-seq，單核苷酸分辨率系統(tǒng)地檢測了人類細胞系和人外周血單核細胞(PBMC)中miRNAs上的(h)m5C修飾，并通過開發(fā)的專用的分析流程(MAmBA)分析了樣本中的(h)m5C甲基化圖譜，發(fā)現(xiàn)(h)m5C是人miRNAs中廣泛存在的修飾，并不局限于CG序列，并且通過m5C和hm5C的抗體免疫沉淀驗證了實驗結果，也首次表明了人類miRNA包含hm5C修飾。
（詳細解讀：BS-miRNA-seq技術發(fā)現(xiàn)人類microRNA中CpG和非CpG上的(h)m5C修飾）
參考文獻：
Yang Y, et al.RNA 5-Methylcytosine Facilitates the Maternal-to-Zygotic Transition by Preventing Maternal mRNA Decay. Mol Cell. 2019 Sep 19;75(6):1188-1202.e11.
Chen X, et al.5-methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs. Nat Cell Biol. 2019 Aug;21(8):978-990.
Yang X, et al.5-methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Res. 2017 May;27(5):606-625.
Carissimi C, et al.Bisulphite miRNA-seq reveals widespread CpG and non-CpG 5-(hydroxy)methyl-Cytosine in human microRNAs. RNA Biol. 2021 Dec;18(12):2226-2235.
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RNA甲基化
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