細(xì)胞死亡的相關(guān)研究一直是生命科學(xué)領(lǐng)域的熱點。依據(jù)發(fā)生機制的不同 (起始的刺激、中間過程的激活和末端的效應(yīng)器的不同) ，細(xì)胞的死亡可以區(qū)分為不同的方式，常見的有細(xì)胞凋亡、焦亡、壞死、鐵死亡等。 

 

圖 1. 不同死亡方式的比較

 

"鐵死亡"的相關(guān)研究更是近幾年熱點中的“熱點“，這也證明了金屬元素在細(xì)胞死亡中的獨特作用。迎來鐵死亡，又遇銅死亡。

 

今年 3 月題為 Copper induced cell death by targeting lipoylated TCA cycle protein 一文提出：生物體內(nèi)不可缺少的微量元素—銅在其濃度超過了維持穩(wěn)態(tài)機制的閾值時也會表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。這種現(xiàn)象與鐵積累導(dǎo)致細(xì)胞死亡的情況有相似之處 (但機制明顯區(qū)別于鐵死亡)。研究人員將這種銅離子誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的機制命名為 “銅死亡” (Cuproptosis)。

 

■ 銅死亡的簡要機制

銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡: 當(dāng) Cu²⁺ 在依賴線粒體呼吸的細(xì)胞中過度積累 (Cu²⁺ 通過銅離子載體運入細(xì)胞)，Cu²⁺ 與硫辛�；� DLAT 結(jié)合，誘導(dǎo) DLAT 的異聚化。不溶性 DLAT 的增加導(dǎo)致細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

 

注：蛋白質(zhì)硫辛�；�修飾是一種保守的賴氨酸翻譯后修飾，只發(fā)生在涉及 TCA 循環(huán)的四種蛋白，其中就包括 DLAT。DLAT 是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體 (PDH Complex) 組分之一，丙酮酸脫氫酶可催化 TCA 循環(huán)中的丙酮酸脫羧生成乙酰輔酶 A。

 

FDX1 (一種還原酶、Elesclomol 的直接靶標(biāo)) 作為蛋白質(zhì)硫辛酰化修飾的上游調(diào)節(jié)因子，一方面，參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì) (包括 DLAT) 的硫辛�；�。另一方面，F(xiàn)DX1 將 Cu²⁺ 還原成更具毒性的 Cu⁺，導(dǎo)致 Fe-S 簇蛋白合成的抑制，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

 

銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞死亡: 銅的穩(wěn)態(tài)主要依賴與三個銅轉(zhuǎn)運蛋白 SLC31A1、ATP7A/B、SLC31A1，SLC31A1 負(fù)責(zé)攝入銅，ATP7A 和 ATP7B 負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)出銅。銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞死亡與銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的機制一致。

 

 

 

■ 銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡

在這篇文章中，研究人員測試了 1448 個銅離子載體 (一種高度親脂性的 Cu²⁺ 結(jié)合分子，可將銅離子送入細(xì)胞)，發(fā)現(xiàn)對 489 個細(xì)胞系的細(xì)胞殺傷作用 (圖 3A)。以 Elesclomol (一種高度親脂性的 Cu²⁺ 載體) 為例，單獨加入 Elesclomol 不影響細(xì)胞的生長，同時加入銅離子，細(xì)胞生長就會受到極大抑制，而其他金屬離子 (鐵、鈷、鋅和鎳等) 并不會影響細(xì)胞的生長 (圖 3B)。使用 NSC-319726，Disulfiram 等其它銅離子載體處理細(xì)胞也得到了相同的結(jié)果 (圖 3D-E)。

 

但使用 Tetrathiomolybdate (TTM；一種銅螯合劑) 聯(lián)合 Elesclomol 處理細(xì)胞，可以緩解 Elesclomol 對細(xì)胞的殺傷作用。這些結(jié)果表明銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡主要依賴于細(xì)胞內(nèi)銅的積累。 

 

圖 3. 銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡對銅具有高度選擇性^[2]

A：1448 個銅離子載體對 489 個細(xì)胞系的生長抑制；B：不同金屬離子的情況下，用 Elesclomol 處理 MON 細(xì)胞；C：其他銅離子載體條件的細(xì)胞活力測定 D：使用 TTM 預(yù)處理 ABC1 細(xì)胞，然后 Elesclomol 處理

 
■ 銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡是非凋亡性的

有研究表明 Elesclomol 誘導(dǎo)活性氧依賴性細(xì)胞凋亡，但實驗結(jié)果表明 Elesclomol 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡不涉及 Caspase 3 (細(xì)胞凋亡的標(biāo)志) 的切割或激活 (圖 4D-E)。并且當(dāng)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)子 BAX 和 BAK1 被敲除時，以及用 Caspase 抑制劑 (Z-VAD-FMK 和 Boc-D-FMK) 處理細(xì)胞，Elesclomol 仍然維持對細(xì)胞的殺傷潛力，此外，其他已知細(xì)胞死亡機制的抑制劑處理細(xì)胞 (包括鐵死亡 (Ferrostatin-1)、壞死性凋亡 (Necrostatin-1) 和氧化應(yīng)激 (N-acetylcysteine) )，也都未能消除銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。

這些結(jié)果表明銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡機制與細(xì)胞凋亡途徑不同。

 

 

圖 4. 銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡不通過凋亡^[2]

A：ICP-MS 檢測細(xì)胞內(nèi)的銅離子和鋅離子；B：ES-Cu 處理 細(xì)胞，檢測 Caspase 3/7 的激活；C：檢測 Caspase 3 的表達(dá)；F：用 Elesclomol-CuCl₂ 處理 KO 細(xì)胞，檢測細(xì)胞活力；

 
■ 線粒體呼吸調(diào)節(jié)銅離子誘導(dǎo)細(xì)胞死亡
研究人員觀察到主要依賴線粒體呼吸的細(xì)胞對銅離子的敏感性更高 (圖 5A)。用線粒體抗氧化劑、脂肪酸和線粒體功能抑制劑等線粒體呼吸途徑相關(guān)的抑制劑處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)：電子傳遞鏈復(fù)合物的抑制劑和線粒體丙酮酸攝取抑制劑 (UK5099) 處理的條件下，銅離子誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡受抑制，鐵死亡抑制劑的處理對其沒有影響 (GPX4 抑制劑 ML162) (圖 5B)。
 
此外，線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)劑 FCCP 處理對銅離子誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡沒有影響。這些結(jié)果表明線粒體呼吸途徑是銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的必要條件。
 
研究人員還對比了缺氧條件刺激以及 FG-4592 激活缺氧誘導(dǎo)因子 (HIF) 途徑，發(fā)現(xiàn)只有真實缺氧條件會降低細(xì)胞對銅離子載體的敏感性 (圖 5D)，進一步確認(rèn)了線粒體呼吸在銅誘導(dǎo)細(xì)胞死亡中的關(guān)鍵作用。
 
隨后，研究人員分析銅離子處理對細(xì)胞耗氧率 (OCR) 的影響，結(jié)果顯示 Elesclomol 的處理會影響細(xì)胞的最大耗氧量 (圖 5E)。這表明銅離子可能不直接影響電子傳遞鏈，而是影響三羧酸循環(huán) (TCA)。

 

 
■ FDX1 和蛋白硫辛�；�是銅細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者

為進一步闡明銅離子和 TCA 循環(huán)之間的聯(lián)系。研究人員使用 CRISPR-Cas9 技術(shù)，分別敲除不同的基因，再使用銅離子載體 (Elesclomol-copper) 處理細(xì)胞，以確定涉及參與銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的基因。

 

結(jié)果發(fā)現(xiàn)有 7 個基因的敲除可以明顯緩解銅離子載體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用 (圖 6A-C)，包括 FDX1，LIPT1、LIAS、DLD (硫辛酸途徑的三個關(guān)鍵酶)，DLAT、PDHA1、PDHB (丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的三個組分)。另外，敲除 FDX1 和 LIAS 基因明顯減輕銅離子載體引起的細(xì)胞毒性(圖 6D-E)，研究人員猜測 FDX1 有可能是蛋白質(zhì)硫辛�；�修飾的上游調(diào)節(jié)因子。

 

 

為進一步驗證這個假設(shè)，研究人員通過資源庫 Cancer Dependency Map，發(fā)現(xiàn) FDX1 和硫辛酸途徑相關(guān)蛋白在銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡方面是高度相關(guān)的 (圖 7A)。隨后，研究人員選取腫瘤樣本，對 FDX1 和硫辛�；�蛋白進行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn) FDX1 和硫辛�；�蛋白表達(dá)顯著相關(guān) (圖 7B-C)。敲除 FDX1 會導(dǎo)致 DLAT 蛋白和 DLST 蛋白的硫辛�；�缺失 (圖 7D)，還會導(dǎo)致細(xì)胞呼吸水平下降 (圖 7E)。

 

此外，研究人員通過代謝物分析發(fā)現(xiàn)敲除 FDX1 會導(dǎo)致丙酮酸和 α-酮戊二酸積累和琥珀酸的的消耗。還觀察到 LIAS 的關(guān)鍵底物 S-腺苷甲硫氨酸 (SAM) 的積累。這些結(jié)果表明 FDX1 是蛋白質(zhì)硫辛�；�的上游調(diào)節(jié)劑 (圖 7F)。

 
■ 銅直接結(jié)合并誘導(dǎo)硫辛�；� DLAT 的寡聚化
有研究報道銅離子與游離脂酸的離解常數(shù)為 10^–17，這表明銅離子有可能直接與硫辛酰化蛋白結(jié)合。為了驗證這一猜想，研究人員純化了 DLAT 和 DLST 蛋白，發(fā)現(xiàn) DLAT 和 DLST 都可以與偶聯(lián)銅的樹脂結(jié)合 (圖 8A)。而敲除 FDX1 會導(dǎo)致 DLAT 蛋白的硫辛�；�修飾消失，且 DLAT 和 DLST 也不再與偶聯(lián)銅的樹脂結(jié)合 (圖 8B)。這表明蛋白質(zhì)的硫辛酰化修飾是結(jié)合銅的必要條件。此外，銅與硫辛酰化蛋白 DLAT 的結(jié)合，會導(dǎo)致蛋白的寡聚化。而 Elesclomol 處理會增加 DLAT 蛋白的寡聚化 (圖 8C-D)。
上述結(jié)果表明：在銅離子載體處理后硫辛�；�蛋白的毒性是由它們異常的寡聚作用介導(dǎo)的。此外質(zhì)譜分析還發(fā)現(xiàn)銅離子載體處理會導(dǎo)致 Fe-S 簇蛋白的水平降低 (圖 8E)，這整個過程都依賴于 FDX1 蛋白的存在。
 

 

■ 銅誘導(dǎo)細(xì)胞死亡機制與銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)的遺傳模型相同
銅的穩(wěn)態(tài)主要依賴與三個銅轉(zhuǎn)運蛋白 (圖 9A)。為了進一步驗證與銅離子載體介導(dǎo)的死亡與自然狀態(tài)下的銅紊亂的機制是否相同，研究人員過表達(dá) SLC31A1(圖 9B)。另外，過表達(dá) SLC31A1 的細(xì)胞被銅離子載體處理后蛋白硫辛�；瘻p少，F(xiàn)e-S 簇蛋白水平降低，HSP70 水平升高 (圖 9C)。
 
在過表達(dá) SLC31A1 的細(xì)胞中使用鐵死亡、壞死性凋亡和凋亡抑制劑不影響銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，銅螯合劑卻可緩解銅離子載體產(chǎn)生的細(xì)胞殺傷作用 (圖 9D)。老年 ATP7B 缺陷小鼠 (Atpb7b^−/−，銅失調(diào)綜合征 Wilson’s disease 模型) 與雜合子 (Atpb7b^+/−) 和野生型對照小鼠對比，發(fā)現(xiàn) ATP7B 缺陷小鼠的肝臟中蛋白的硫辛�；�水平和 Fe-S 簇蛋白的含量均有顯著降低，Hsp70 蛋白則有明顯增加 (圖 9F)。多種模型證明銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞死亡和銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是同一種機制。

 

 

 

總結(jié)：
 
這項研究通過利用多種死亡方式的誘導(dǎo)劑與抑制劑從多維度闡明了銅離子誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是一種新型細(xì)胞死亡即銅死亡。研究人員發(fā)現(xiàn)銅離子積累主要通過調(diào)控 FDX1 來介導(dǎo)銅死亡。
 
一方面，F(xiàn)DX1 將 Cu²⁺ 還原成更具毒性的 Cu⁺，可促使 TCA 循環(huán)中硫辛�；�蛋白異常寡聚化，另一方面，F(xiàn)DX1 導(dǎo)致 Fe-S 簇蛋白的不穩(wěn)定。
 

 

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參考文獻

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4. Tang D, Chen X, Kroemer G. Cuproptosis: a copper-triggered modality of mitochondrial cell death. Cell Res. 2022;32(5):417-418.