MeRIP-seq揭示衰老和神經(jīng)變性過程中m6A RNA甲基化修飾的保守下調(diào)機制
2023年02月22日，《美國國家科學(xué)院院刊》(Proc Natl Acad Sci USA)期刊發(fā)表了題為“Conserved reduction of m6A RNA modifications during aging and neurodegeneration is linked to changes in synaptic transcripts”的研究論文，該研究通過對小鼠和人的健康腦組織和AD（阿爾茨海默病，Alzheimer’s disease）患病腦組織進行MeRIP-seq、RNA-seq、MeRIP-qPCR等實驗，揭示m6A修飾減少與突觸蛋白合成受損相關(guān)。
標(biāo)題：Conserved reduction of m6A RNA modifications during aging and neurodegeneration is linked to changes in synaptic transcripts（衰老和神經(jīng)變性過程中m6A RNA修飾減少與突觸轉(zhuǎn)錄本變化相關(guān)）
時間：2023.02.22
期刊：Proc Natl Acad Sci USA
影響因子：IF 12.779
技術(shù)平臺：MeRIP-seq、RNA-seq、MeRIP-qPCR、Polysome-seq、H3K36me3 ChIP-seq等
樣本實驗：
研究摘要：
N6-甲基腺苷（m6A）調(diào)控mRNA代謝。盡管已有研究表明m6A修飾與哺乳動物大腦的發(fā)育和認(rèn)知相關(guān)，但m6A在突觸可塑性中（尤其是在認(rèn)知衰退期間）的作用尚未完全了解。本研究采用甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq）繪制了年輕（young）和老年（aged）小鼠海馬亞區(qū)CA1、CA3和齒狀回以及前扣帶皮層（anterior cingulate cortex，ACC）的m6A表觀轉(zhuǎn)錄組圖譜，結(jié)果表明老年小鼠的m6A水平降低。對認(rèn)知完整的健康人類和阿爾茨海默�。ˋD）患者的扣帶皮層（CC）腦組織的MeRIP-seq比較分析顯示，AD患者中m6A RNA甲基化水平降低。在與突觸功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本中發(fā)現(xiàn)老年小鼠和AD患者大腦常見的m6A變化，包括鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶2（CAMKII）和AMPA選擇性谷氨酸受體1（Glua1），鄰近連接試驗表明，m6A水平降低導(dǎo)致突觸蛋白合成（如CAMKII和GLUA1）減少。此外m6A水平降低還會導(dǎo)致突觸功能受損。本研究結(jié)果表明，m6A RNA甲基化調(diào)控突觸蛋白合成，并可能在與衰老和AD相關(guān)的認(rèn)知衰退中發(fā)揮作用。
研究意義：
本研究描述了小鼠和人類的健康和AD患病大腦中的全基因組m6A表觀轉(zhuǎn)錄組圖譜。數(shù)據(jù)分析表明，大量的m6A轉(zhuǎn)錄本保守，且這些轉(zhuǎn)錄本集中在突觸處富集、與突觸過程的調(diào)控有關(guān)。研究人員在AD小鼠模型的腦組織和患有阿爾茨海默病患者的扣帶回腦組織中檢測到m6A RNA甲基化水平降低。本研究在機制水平上證明了m6A修飾減少與受損的突觸蛋白合成相關(guān)。
結(jié)果圖形
（1）成年小鼠大腦中的m6A圖譜
本研究通過表征健康成年小鼠大腦中m6A RNA修飾圖譜來開始分析。提取并解剖了十只（C57BL/6J）3月齡（young）野生型（WT）小鼠的大腦，以獲得海馬亞區(qū)CA1、CA3和齒狀回（DG）以及前扣帶皮層（ACC），實驗所用樣本與學(xué)習(xí)和記憶過程以及認(rèn)知疾病有關(guān)。對樣本進行甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq）以鑒定年輕成年小鼠的亞區(qū)域特異性表觀轉(zhuǎn)錄組圖譜。
圖1：成年小鼠大腦的m6A RNA甲基化圖譜。
這些數(shù)據(jù)表明常見的m6A轉(zhuǎn)錄本可能在突觸處特異性富集，為了進一步深入研究，作者利用最近發(fā)表的包含高可信度的海馬突觸RNAome數(shù)據(jù)集，并將其與海馬表觀轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行比較分析。在這兩個數(shù)據(jù)集中觀察到突觸在mRNA中甲基化轉(zhuǎn)錄本中的強富集，超過70%的突觸體和64%的微流體室轉(zhuǎn)錄組中至少有一個m6A peaks�；诒狙芯繑�(shù)據(jù)列表與其他數(shù)據(jù)庫的交叉比較分析，表明m6A RNA修飾是成年大腦突觸功能的關(guān)鍵調(diào)控過程。
（2）成年人腦中的m6A甲基化修飾揭示了與突觸功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本保守富集
接下來，作者對5個死后認(rèn)知未衰退健康人腦的扣帶皮層（CC）組織進行MeRIP-seq，以描繪人腦轉(zhuǎn)錄本中的m6A分布。
（3）小鼠認(rèn)知衰退模型和人類AD患者腦組織中的m6A RNA變化
通過MeRIP-seq數(shù)據(jù)證明了通過m6A修飾調(diào)控突觸組織、功能和可塑性可能是成年哺乳動物大腦中的保守機制。為了進一步探索這一點，作者選擇鼠年齡相關(guān)記憶障礙作為認(rèn)知衰退模型系統(tǒng)研究了m6A修飾變化機制。
圖4：表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)在神經(jīng)變性和衰老中的變化。
（4）m6A水平降低影響可塑相關(guān)蛋白CAMKII的合成
本研究通過MeRIP-seq等實驗闡明了m6A RNA修飾在年輕和老年小鼠大腦以及認(rèn)知完整的人類和AD患者大腦中的功能，為該領(lǐng)域的進一步研究提供了重要資源。由于在大腦衰老和AD中觀察到突觸基因的m6A RNA甲基化降低，因此靶向m6A RNA甲基化機制可能是預(yù)防認(rèn)知衰退的頗具前景的策略。
參考文獻(xiàn)：
Castro-Hernández R,et al. Conserved reduction of m6A RNA modifications during aging and neurodegeneration is linked to changes in synaptic transcripts. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023 Feb 28;120(9):e2204933120.
時間：2023.02.22
期刊：Proc Natl Acad Sci USA
影響因子：IF 12.779
技術(shù)平臺：MeRIP-seq、RNA-seq、MeRIP-qPCR、Polysome-seq、H3K36me3 ChIP-seq等
樣本實驗：
研究摘要：
N6-甲基腺苷（m6A）調(diào)控mRNA代謝。盡管已有研究表明m6A修飾與哺乳動物大腦的發(fā)育和認(rèn)知相關(guān)，但m6A在突觸可塑性中（尤其是在認(rèn)知衰退期間）的作用尚未完全了解。本研究采用甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq）繪制了年輕（young）和老年（aged）小鼠海馬亞區(qū)CA1、CA3和齒狀回以及前扣帶皮層（anterior cingulate cortex，ACC）的m6A表觀轉(zhuǎn)錄組圖譜，結(jié)果表明老年小鼠的m6A水平降低。對認(rèn)知完整的健康人類和阿爾茨海默�。ˋD）患者的扣帶皮層（CC）腦組織的MeRIP-seq比較分析顯示，AD患者中m6A RNA甲基化水平降低。在與突觸功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本中發(fā)現(xiàn)老年小鼠和AD患者大腦常見的m6A變化，包括鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶2（CAMKII）和AMPA選擇性谷氨酸受體1（Glua1），鄰近連接試驗表明，m6A水平降低導(dǎo)致突觸蛋白合成（如CAMKII和GLUA1）減少。此外m6A水平降低還會導(dǎo)致突觸功能受損。本研究結(jié)果表明，m6A RNA甲基化調(diào)控突觸蛋白合成，并可能在與衰老和AD相關(guān)的認(rèn)知衰退中發(fā)揮作用。
研究意義：
本研究描述了小鼠和人類的健康和AD患病大腦中的全基因組m6A表觀轉(zhuǎn)錄組圖譜。數(shù)據(jù)分析表明，大量的m6A轉(zhuǎn)錄本保守，且這些轉(zhuǎn)錄本集中在突觸處富集、與突觸過程的調(diào)控有關(guān)。研究人員在AD小鼠模型的腦組織和患有阿爾茨海默病患者的扣帶回腦組織中檢測到m6A RNA甲基化水平降低。本研究在機制水平上證明了m6A修飾減少與受損的突觸蛋白合成相關(guān)。
結(jié)果圖形
（1）成年小鼠大腦中的m6A圖譜
本研究通過表征健康成年小鼠大腦中m6A RNA修飾圖譜來開始分析。提取并解剖了十只（C57BL/6J）3月齡（young）野生型（WT）小鼠的大腦，以獲得海馬亞區(qū)CA1、CA3和齒狀回（DG）以及前扣帶皮層（ACC），實驗所用樣本與學(xué)習(xí)和記憶過程以及認(rèn)知疾病有關(guān)。對樣本進行甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq）以鑒定年輕成年小鼠的亞區(qū)域特異性表觀轉(zhuǎn)錄組圖譜。
圖1：成年小鼠大腦的m6A RNA甲基化圖譜。
- 實驗方案。
- 上：根據(jù)input計算海馬CA1、CA3和DG區(qū)域中m6A甲基化轉(zhuǎn)錄本百分比餅圖。下：注釋的轉(zhuǎn)錄區(qū)域的m6A peaks位點。百分比由m6A peaks總數(shù)計算。
- 海馬亞區(qū)mRNA上m6A peaks分布吉他圖。
- 海馬亞區(qū)m6A甲基化轉(zhuǎn)錄本Venn圖。
- 所有海馬區(qū)域中檢測到的m6A甲基化轉(zhuǎn)錄本GO富集分析
- 上：在ACC轉(zhuǎn)錄組中m6A RNA甲基化的分布。下：注釋的轉(zhuǎn)錄本區(qū)域的m6A peaks位點。
- ACC中mRNA的m6A peaks分布吉他圖
- 比較海馬和ACC中m6A常見甲基化轉(zhuǎn)錄本Venn圖。
- 海馬和ACC中常見m6A甲基化轉(zhuǎn)錄本中突觸特異性GO富集分析Sunburst圖。
- 從海馬突觸體或從微流體室（microfluid chamber）中分離突觸中獲得的RNA-seq數(shù)據(jù)集中m6A甲基化轉(zhuǎn)錄本百分比餅圖。ACC-前扣帶皮層，DG-齒狀回，5‘UTR-5'非翻譯區(qū)，3’UTR-3'非翻譯區(qū)，CDS-編碼序列，ncRNA-非編碼RNA。
這些數(shù)據(jù)表明常見的m6A轉(zhuǎn)錄本可能在突觸處特異性富集，為了進一步深入研究，作者利用最近發(fā)表的包含高可信度的海馬突觸RNAome數(shù)據(jù)集，并將其與海馬表觀轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行比較分析。在這兩個數(shù)據(jù)集中觀察到突觸在mRNA中甲基化轉(zhuǎn)錄本中的強富集，超過70%的突觸體和64%的微流體室轉(zhuǎn)錄組中至少有一個m6A peaks�；诒狙芯繑�(shù)據(jù)列表與其他數(shù)據(jù)庫的交叉比較分析，表明m6A RNA修飾是成年大腦突觸功能的關(guān)鍵調(diào)控過程。
（2）成年人腦中的m6A甲基化修飾揭示了與突觸功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本保守富集
接下來，作者對5個死后認(rèn)知未衰退健康人腦的扣帶皮層（CC）組織進行MeRIP-seq，以描繪人腦轉(zhuǎn)錄本中的m6A分布。
圖2：小鼠和人之間保守的m6A修飾。
- 上：根據(jù)input計算人CC中m6A甲基化轉(zhuǎn)錄本百分比餅圖。下圖：注釋的轉(zhuǎn)錄區(qū)域m6A peaks位點。
- 人CC中mRNA上m6A修飾分布吉他圖
- m6A peaks的motif分析鑒定出m6A DRACH共有motif（D=A、T或G，R=A或G，H=A、T或C）。
- 左：分別在人/小鼠中已知同源物的小鼠/人基因Doughnut圖，用于比較不同物種的甲基化轉(zhuǎn)錄本。右：比較成年小鼠ACC和人CC中m6A甲基化同源轉(zhuǎn)錄本的Venn圖。
- 小鼠ACC和人CC共有m6A甲基化轉(zhuǎn)錄本的GO分析（生物學(xué)過程）。
- 小鼠ACC和人CC共有m6A甲基化轉(zhuǎn)錄本GO富集分析的突觸特異性Sunburst圖。
- 在小鼠ACC和人CC（CAMKIIb/CAMKIIb）中的Camk2b沿同源轉(zhuǎn)錄本3'端保守的m6A修飾代表性覆蓋軌跡。軌跡根據(jù)相應(yīng)input和文庫大小歸一化的m6A RIP覆蓋值。以RPM為單位刻度。
- 人CC特異性m6A甲基化轉(zhuǎn)錄本的GO分析。
- 與突觸RNA相比，保守轉(zhuǎn)錄本（通常在小鼠和人類中檢測到）與人和小鼠特異性轉(zhuǎn)錄本之間相關(guān)聯(lián)的優(yōu)勢比熱圖。
（3）小鼠認(rèn)知衰退模型和人類AD患者腦組織中的m6A RNA變化
通過MeRIP-seq數(shù)據(jù)證明了通過m6A修飾調(diào)控突觸組織、功能和可塑性可能是成年哺乳動物大腦中的保守機制。為了進一步探索這一點，作者選擇鼠年齡相關(guān)記憶障礙作為認(rèn)知衰退模型系統(tǒng)研究了m6A修飾變化機制。
圖3：老年小鼠大腦中的組織特異性m6A變化
- 實驗方案。
- 在相應(yīng)的腦亞區(qū)中檢測到的差異表達(dá)和差異甲基化基因數(shù)量條形圖，對FC和調(diào)整后的P值應(yīng)用相同的截止值（FC>1.2，padj≤0.05）。
- 在分析的大腦亞區(qū)中m6A甲基化轉(zhuǎn)錄本百分比餅圖，其中包含在衰老過程中僅甲基化水平降低（低甲基化）和僅甲基化水平增加（高甲基化）的peaks，或m6A peaks減少和增加（混合）的混合peaks。
- 所研究大腦區(qū)域轉(zhuǎn)錄本中顯著低甲基化m6A peaks的注釋分布條形圖。
- 比較海馬亞區(qū)和ACC的低甲基化轉(zhuǎn)錄本Venn圖。深紅色矩形表示在所有海馬亞區(qū)檢測到的87個轉(zhuǎn)錄本。相應(yīng)的右/上圖顯示了這些轉(zhuǎn)錄本的GO富集分析（生物過程）。黑色矩形表示海馬和ACC中通常低甲基化的33個轉(zhuǎn)錄本，右/下圖顯示了相應(yīng)的GO富集分析。
- 兩個差異甲基化基因（低甲基化和高甲基化）的qPCR驗證。圖中顯示了MeRIP-seq和MeRIP–qPCR檢測到的甲基化FC。MeRIP-seq數(shù)據(jù)列表顯示了FDR的平均FC，由ExomePeak計算。MeRIP-qPCR數(shù)據(jù)列表顯示了每個條件四個獨立重復(fù)的平均值±SEM。統(tǒng)計顯著性由Student's t檢驗確定，P值顯示在比較值上方。
圖4：表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)在神經(jīng)變性和衰老中的變化。
- AD組與對照組樣品中差異表達(dá)和差異m6A甲基化轉(zhuǎn)錄本數(shù)量條形圖，對FC和調(diào)整后的P值應(yīng)用相同的截止值（FC>1.2，padj≤0.05）。
- 與對照組相比，AD樣本中低甲基化、高甲基化和混合轉(zhuǎn)錄本的比例餅圖。
- 與對照組相比，AD中m6A低甲基化轉(zhuǎn)錄本（FC>1.5）的GO富集分析。
- AD中低甲基化轉(zhuǎn)錄本m6A peaks分布條形圖。
- 比較老年小鼠ACC和人AD患者CC中顯著低甲基化轉(zhuǎn)錄本Venn圖，突出顯示的是CaMKII亞型。
- KEGG通路LTP圖（hsa04720）。紫色突出顯示的是AD患者的老年小鼠ACC和人CC中通常低甲基化的轉(zhuǎn)錄本。CAMKII也屬于該組，但由于其低甲基化通過qPCR（H）驗證，因此以紅色突出顯示。
- 在年輕與老年小鼠、健康對照與AD患者中的人CC大腦中CamkII亞型的m6A低甲基化條形圖。每條代表最接近終止密碼子的相應(yīng)轉(zhuǎn)錄本的3‘UTR中的甲基化位點。
- qPCR驗證不同CamkII亞型的3‘UTR中低甲基化區(qū)域。圖中顯示通過MeRIP-seq和MeRIP-qPCR檢測的m6A甲基化中的FC。誤差條顯示6/4（young/aged）獨立重復(fù)的平均值±SEM；P值顯示在比較上方。統(tǒng)計顯著性通過Student's t檢驗和Welch對不等方差的校正進行評估。
（4）m6A水平降低影響可塑相關(guān)蛋白CAMKII的合成
圖5：m6A水平變化影響CAMKII突觸蛋白合成
- 用靶向Mettl3（Mettl3 KD）或相應(yīng)對照寡核苷酸（對照）的GAPmer處理神經(jīng)元培養(yǎng)物中Mettl3表達(dá)的qPCR結(jié)果條形圖。
- 代表性的immunoblot分析顯示METTL3蛋白水平響應(yīng)于GAPmer介導(dǎo)的METTL3敲除。
- B的量化。
- GAPmer介導(dǎo)的Mettl3敲除后的主要m6A水平。A、C和D中的圖表顯示了每個條件的平均值±SEM。每個數(shù)據(jù)點代表一個獨立的復(fù)制。
- 用于量化原代神經(jīng)元中CAMKII合成的puro-PLA標(biāo)記示意圖。
- 用對照或Mettl3 KD GAPmers處理的原代海馬神經(jīng)元的代表性圖像。（比例尺，20μm）CAMKII-PLA信號顯示為綠色，SYP顯示為紅色，Map2顯示為藍(lán)色。右圖顯示了代表性樹突的高倍圖像（比例尺，10μm）。箭頭表示突觸附近的CAMKII合成位點。
- 處理的神經(jīng)元中檢測到的PLA點總數(shù)的Violin圖。陰性對照（NegC）在PLA前未經(jīng)嘌呤霉素處理。
- 比較對照和Mettl3 KD處理的神經(jīng)元中突觸定位的CAMKII-PLA點的Violin圖。G和H中的圖顯示三個獨立實驗的平均值；每個實驗對7-13個神經(jīng)元進行成像和分析。四分位數(shù)用灰線標(biāo)記。
- 微流體室中生長的原代神經(jīng)元突觸室中歸一化CAMKIIa mRNA水平。I中的點代表神經(jīng)元培養(yǎng)體的獨立重復(fù)。
本研究通過MeRIP-seq等實驗闡明了m6A RNA修飾在年輕和老年小鼠大腦以及認(rèn)知完整的人類和AD患者大腦中的功能，為該領(lǐng)域的進一步研究提供了重要資源。由于在大腦衰老和AD中觀察到突觸基因的m6A RNA甲基化降低，因此靶向m6A RNA甲基化機制可能是預(yù)防認(rèn)知衰退的頗具前景的策略。
參考文獻(xiàn)：
Castro-Hernández R,et al. Conserved reduction of m6A RNA modifications during aging and neurodegeneration is linked to changes in synaptic transcripts. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023 Feb 28;120(9):e2204933120.
- 空間和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)綜合分析揭示與不良預(yù)后相關(guān)的中間癌細(xì)胞群
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