本期我們通過3篇高分文章來解讀微量樣本甲基化測序在腫瘤中的應(yīng)用。
 
01 肝細(xì)胞癌診斷和預(yù)后
大家好，這里是專注表觀組學(xué)十余年，領(lǐng)跑多組學(xué)科研服務(wù)的易基因。本期我們通過3篇高分文章來解讀微量樣本甲基化測序在腫瘤中的應(yīng)用。
 

標(biāo)題：Circulating tumour DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma（循環(huán)腫瘤DNA甲基化標(biāo)志物在肝細(xì)胞癌診斷和預(yù)后中的價值）
期刊：Nature materials
2021影響因子: 43.841
發(fā)表時間：2017.11

摘要：
目前還沒有一種有效的基于血液的方法來診斷和判斷肝細(xì)胞癌(HCC)的預(yù)后。攜帶癌癥特異性遺傳和表觀遺傳突變的循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)可以實現(xiàn)非侵入性的“液體活檢”，用于癌癥的診斷和監(jiān)測。在這里，作者通過比較肝癌組織和正常白細(xì)胞，確定了一組肝癌特異性甲基化標(biāo)志物，并顯示肝癌腫瘤DNA和匹配的血漿ctDNA的甲基化特征高度相關(guān)。利用來自1,098例肝癌患者和835例正常對照的cfDNA樣本，作者構(gòu)建了一個在診斷方面具有特異性和高度敏感性(P<0.001)的診斷預(yù)測模型，該模型與腫瘤負(fù)荷、治療反應(yīng)和分期高度相關(guān)。此外，作者還建立了預(yù)后預(yù)測模型，有效地預(yù)測了患者的預(yù)后和生存期(P<0.001)。這些發(fā)現(xiàn)共同證明了ctDNA甲基化標(biāo)記物在肝癌的診斷、監(jiān)測和預(yù)后中的作用。

隊列：
為了研究肝細(xì)胞癌的ctDNA，作者采集了中國肝細(xì)胞癌患者和隨機(jī)選擇的健康對照者的血漿樣本，得到了715名肝癌患者和560名正常健康對照的訓(xùn)練隊列，以及383名肝癌患者和275名健康對照的驗證隊列。

結(jié)果：
ctDNA在血液中的含量極微，每毫升血中僅有約20ng，并且混雜在更大量的正常游離DNA中，在這么微量的ctDNA中檢測單個堿基的甲基化水平具有很大的挑戰(zhàn)。

作者首先從全基因組水平上對肝癌組織和正常血液DNA的485，000個CpG位點甲基化水平進(jìn)行了比較，篩選出差異性最顯著的位點；設(shè)計相應(yīng)的鎖式探針(Padlock probe)，對近兩千例肝癌和正常人血漿中提取的微量ctDNA進(jìn)行了甲基化PCR擴(kuò)增和測序（探針捕獲靶向甲基化測序）；確定了這些位點的甲基化水平后，進(jìn)而通過大量的統(tǒng)計學(xué)分析和計算，并利用多種人工智能模擬的機(jī)器學(xué)習(xí)方法，最后分別篩選出10個和8個位點建立了診斷模型和生存預(yù)后模型（圖1)。
 

圖1.數(shù)據(jù)生成和分析流程圖

該診斷模型在訓(xùn)練隊列715例肝癌患者和560例正常人中的診斷敏感性和特異性分別達(dá)到了85.7%和94.3%（圖2a），在驗證隊列383例肝癌患者和275例正常人中的診斷敏感性和特異性分別達(dá)到了83.3%和90.5%（圖2b）。作者還證明了這個模型可以將肝癌與正常對照區(qū)分開來(圖2c、d)，此外，這10個標(biāo)記物的無監(jiān)督分級聚類能夠以高度的特異性和敏感度將HCC與正常對照區(qū)分開來(圖2e，f)。
   
此外，該模型還能準(zhǔn)確的反映肝癌患者的TNM分期、體內(nèi)有無腫瘤殘留、對治療的反應(yīng)以及有無復(fù)發(fā)等（圖3）。
   
而對1049例生存資料完整的肝癌患者，依據(jù)生存預(yù)后模型進(jìn)行評分，低風(fēng)險組患者的預(yù)后顯著優(yōu)于高風(fēng)險組患者（圖4），顯示出利用該模型可以準(zhǔn)確預(yù)測肝癌患者的預(yù)后，有利于對不同的風(fēng)險的患者進(jìn)行更為個體化的治療。
   
02 腫瘤溯源

標(biāo)題：Identification of methylation haplotype blocks aids in deconvolution of heterogeneous tissue samples and tumor tissue-of-origin mapping from plasma DNA.（甲基化單倍型鑒定有助于異質(zhì)組織樣本的去卷積以及根據(jù)血漿DNA的對腫瘤溯源）

期刊：Nature genetics

2021影響因子: 38.33

發(fā)表時間：2017.4

摘要：
哺乳動物基因組中相鄰的CpG位點可以由于甲基轉(zhuǎn)移酶或去甲基酶的加工性而共享相似的甲基化狀態(tài)，而DNA甲基化是細(xì)胞類型特異性的，并且該模式可以用于分析異源樣品的相對細(xì)胞組成，因此共甲基化的CpG可以作為一組基因組特征用于標(biāo)記組織的來源。作者對人體全基因組中表現(xiàn)出高度一致得甲基化區(qū)域進(jìn)行系統(tǒng)性調(diào)查，使用61組全基因組亞硫酸氫鹽測序(WGBS)數(shù)據(jù)定義了147,888個緊密耦合的CpG位點，稱為甲基化單倍型(MHBs)，并用101組簡化代表性亞硫酸氫鹽測序(RRBS)數(shù)據(jù)和637組甲基化芯片數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗證了這一點。還使用一種稱為甲基化單倍型負(fù)荷(MHL)的指標(biāo)，作者在區(qū)塊（blocks）水平上進(jìn)行了組織特異性甲基化分析。最后，作者使用甲基化單倍型對59例癌癥患者的無細(xì)胞循環(huán)DNA中的腫瘤負(fù)荷和組織起源進(jìn)行了定量估計。

方法：
作者首先通過61 組WGBS數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)了MHB(甲基化單倍型區(qū)塊)，接著利用101 組RRBS數(shù)據(jù)和637組甲基化芯片數(shù)據(jù)對MHB進(jìn)行驗證。建立甲基化單倍型負(fù)荷（MHL）模型，進(jìn)行組織特異性MHB分析，最后使用29個WGBS數(shù)據(jù)和14個RRBS數(shù)據(jù)以及59個RRBS數(shù)據(jù)（癌癥患者血清）；10個RRBS數(shù)據(jù)（和血清配對的腫瘤組織）；75個RRBS數(shù)據(jù)（對照血清）對模型進(jìn)行訓(xùn)練和測試（圖1）。
 

結(jié)果：
由61組WGBS數(shù)據(jù)建立的MHBs代表了一種獨特的基因組特征，它與多個已知的基因組元件部分重疊(圖2)。在所有MHBs中，60828個(41.1%)位于基因間隔區(qū)，87060個(58.9%)位于轉(zhuǎn)錄區(qū)。這些MHBs在增強(qiáng)子、超級增強(qiáng)子、啟動子、CpG島和印記基因上顯著富集(P<1.0×10−6)。
   
 
為了能夠?qū)υS多樣本中單個MHBs中的甲基化模式進(jìn)行定量分析，作者需要一個單一的度量來定義每個區(qū)塊中多個CpG位點的甲基化模式。理想情況下，這一指標(biāo)不僅是區(qū)塊中所有CpG位點的平均甲基化水平的函數(shù)，而且還可以捕捉單個DNA分子上的共甲基化模式。因此，作者定義了甲基化單倍型負(fù)荷(MHL)，對比其他定量方法，NHL表現(xiàn)出更好的MHB區(qū)分能力（圖3）。
   
作者發(fā)現(xiàn)組織特異性MHL在癌癥患者血漿中存在，但在正常血漿或全血中無法檢測到，因此組織特異性MHL在相應(yīng)的組織和癌癥血漿中可見，這表明組織起源標(biāo)測的可行性（圖4a）。接著，作者在基于10個人類正常組織的WGBS和RRBS數(shù)據(jù)集中，篩選出具有組織特異性的MHB（圖4b），將預(yù)測模型應(yīng)用于來自癌癥患者和正常個體的血漿樣品,預(yù)測準(zhǔn)確性平均達(dá)到82.8%, 88.5%, 91.2%（分別是CCP,LCP和NCP樣本）（圖4c）。  
這項研究表明，血漿中的ctDNA甲基化單倍型分型可能是是一種用于早期檢測腫瘤及其主要生長部位，以及連續(xù)監(jiān)測腫瘤進(jìn)展和多器官轉(zhuǎn)移的有效指標(biāo)。
 

03 泛癌種診斷和預(yù)后

標(biāo)題：DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of common cancers（DNA甲基化標(biāo)志物在常見癌癥診斷和預(yù)后中的應(yīng)用）

期刊：Proc Natl Acad Sci U S A.

2021影響因子: 11.205

發(fā)表時間：2017.5

摘要：
使用微創(chuàng)活檢識別特定癌癥對于改善癌癥的診斷、治療選擇和預(yù)后預(yù)測有著很大的幫助。利用來自癌癥基因組圖譜(TCGA)的全基因組甲基化數(shù)據(jù)和機(jī)器學(xué)習(xí)方法，作者評估了DNA甲基化在區(qū)分四種常見癌癥(乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌和肺癌)腫瘤組織和正常組織中的有效性。作者在1,619個腫瘤樣本和173個鄰近正常組織樣本的訓(xùn)練隊列中確定了癌癥標(biāo)記物。作者的發(fā)現(xiàn)在一個單獨的TCGA隊列中得到了驗證，DNA甲基化分析可以預(yù)測癌癥和正常組織，準(zhǔn)確率超過95%，同時也準(zhǔn)確地將30個轉(zhuǎn)移到肝臟的結(jié)直腸癌中的29個和34個轉(zhuǎn)移到肺的結(jié)直腸癌中的32個確定下來。作者發(fā)現(xiàn)這種檢測方法還可以預(yù)測患者的預(yù)后和存活率。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)證明了甲基化生物標(biāo)記物對描述癌癥分子特征的作用，并對診斷和預(yù)后有一定的意義。

結(jié)果：
與不同癌癥類型的甲基化情況相關(guān)的無監(jiān)督等級聚類和熱圖顯示，甲基化圖譜能夠識別癌癥特異性甲基化特征。ROC曲線表明，對不同腫瘤類型的預(yù)測具有較高的敏感性和特異性，因此甲基化特征可以區(qū)分不同的癌癥類型和相應(yīng)的正常組織（圖1）。
 

 
由于識別起源組織對于腫瘤轉(zhuǎn)移患者選擇最佳的治療策略是至關(guān)重要的，因此除了原發(fā)腫瘤外，作者還分析了30例結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移和34例結(jié)直腸癌肺轉(zhuǎn)移病例。研究發(fā)現(xiàn)，無監(jiān)督分級聚類可以將這些轉(zhuǎn)移與結(jié)腸癌或正常組織區(qū)分開來(圖2)。
   
接下來，作者評估了甲基化標(biāo)記對每種癌癥的預(yù)后效果。該模型在Kaplan-Meier分析中區(qū)分低風(fēng)險組和高風(fēng)險組以及具有顯著P值的相關(guān)對數(shù)等級檢驗中表現(xiàn)良好，表明甲基化標(biāo)簽在一定程度上可以預(yù)測BRCA和LUAD的預(yù)后。

鑒于DNA甲基化是基因表達(dá)的重要表觀遺傳調(diào)節(jié)因子，作者研究了癌癥和正常組織中基因位點的差異甲基化是如何與基因表達(dá)相關(guān)的。作者觀察到啟動子甲基化和基因表達(dá)之間的負(fù)相關(guān)，并確定了幾個已知在癌癥發(fā)生中起重要作用的基因，以及在LIHC中功能相對未知的基因。在表達(dá)降低的高甲基化基因中，作者選擇了一個LIHC的相關(guān)基因FUZ，F(xiàn)UZ的過表達(dá)抑制了LIHC細(xì)胞系的生長(圖3)，這說明癌癥甲基化特征與其基因表達(dá)模式和功能相關(guān)。  
作者認(rèn)為，DNA甲基化可以通過更準(zhǔn)確的診斷來幫助患者改善預(yù)后，特別是相對惰性或者侵襲性腫瘤。雖然在本文中只選取了4種常見癌癥，但是作者認(rèn)為，DNA甲基化檢測可以應(yīng)用于更多不同種類的癌癥診療中，其最大的優(yōu)勢在于只需要少量的組織獲得足夠的DNA就可以完成檢測。
 
參考文獻(xiàn)：
https://www.nature.com/articles/nmat4997
https://www.nature.com/articles/ng.3805
https://www.pnas.org/content/114/28/7414