高通量測序后的下游實驗驗證方法之DNA甲基化篇

瀏覽次數(shù)：749　發(fā)布日期：2023-2-28　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責任自負

上一篇，我們分享了DNA甲基化研究的測序數(shù)據(jù)挖掘思路，進而鑒定出研究的目的基因或目標區(qū)域的DNA甲基化。

做完測序后，如果需要對分析結(jié)果中感興趣的內(nèi)容進行后期驗證，則需要進行下游實驗設(shè)計。DNA甲基化研究的后期驗證包括簡單驗證、全基因組甲基化干擾實驗（非靶向）、靶向目標基因的甲基化/去甲基化實驗驗證等。

一、簡單驗證

目標基因DNA甲基化的驗證：Target-BS
檢測目標基因的mRNA表達水平：RT-qPCR
檢測目標基因蛋白質(zhì)表達水平：Western blot

二、全基因組甲基化干擾實驗（非靶向）

DNA甲基化干擾：

ü DNA甲基化酶的敲降/敲除/過表達
ü DNA甲基化抑制劑
阿扎胞苷（5-Aza）能夠通過與DNA甲基化酶DNMT蛋白家族形成共價鍵抑制其酶活性，使細胞的DNA甲基化水平降低。

檢測整體DNA甲基化變化：

ü 5mC甲基化免疫熒光染色（定性）
ü DNA斑點雜交（定性）
ü 比色法（定量）
ü 質(zhì)譜法（定量）

檢測目標基因的DNA甲基化變化：Target-BS
檢測目標基因的mRNA表達水平：RT-qPCR
檢測目標基因蛋白質(zhì)表達水平：Western blot

三、靶向目標基因的甲基化/去甲基化實驗驗證

目的基因DNA甲基化的干擾：

ü 熒光素酶活性分析實驗（Luciferase activity assay）：使用CpG甲基轉(zhuǎn)移酶在體外將質(zhì)粒進行甲基化，構(gòu)建含甲基化/未甲基化啟動子的目標基因-熒光素酶表達質(zhì)粒。
ü CRISPR-Cas9靶向編輯DNA甲基化實驗：在細胞中人為表達目的基因，或通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)靶向編輯DNA甲基化在目的基因上加上/擦除甲基化修飾。

檢測目標基因的DNA甲基化變化：Target-BS
檢測目標基因的mRNA表達水平：RT-qPCR
檢測目標基因蛋白質(zhì)表達水平：Western blot
檢測細胞功能受到的影響:

ü 免疫熒光顯微觀察
ü 功能標志物測定
ü ... ...

CRISPR-Cas9靶向編輯DNA甲基化技術(shù)

目標區(qū)域DNA甲基化的驗證手段——Target-BS（靶基因重亞硫酸鹽測序）

靶向特定區(qū)域進行超高深度甲基化測序。
超高深度：可達幾百到幾千乘。
單個區(qū)域長度<300bp
需要設(shè)計BS引物，進行預(yù)擴增實驗。
WGBS vs. TBS相當于RNA-seq vs. RT-qPCR

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