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文獻(xiàn)精讀第49期

圖1.第一代乙酰膽堿熒光探針GACh的開發(fā)

論文原文鏈接：https://www.nature.com/articles/nbt.4184

2020年9月28日，李毓龍實(shí)驗(yàn)室和北京腦科學(xué)與類腦研究中心的井淼研究員合作，在Nature Methods期刊上發(fā)表了題為“An optimized acetylcholine sensor for monitoring in vivo cholinergic activity”的研究論文。在該研究中，研究團(tuán)隊(duì)在前期工作基礎(chǔ)上，成功優(yōu)化出新一代乙酰膽堿熒光探針（ACh3.0）。與第一代探針相比，新版本的ACh3.0信號(hào)幅度提升了3倍以上，并且還具備親和力高、反應(yīng)速率快以及選擇性強(qiáng)等特征，進(jìn)一步提升在體乙酰膽堿實(shí)時(shí)特異檢測的信噪比。
 

圖2.優(yōu)化后的新一代乙酰膽堿熒光探針

論文原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41592-020-0953-2

02 多巴胺多巴胺（Dopamine, DA）作為大腦中一種重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)功能，參與學(xué)習(xí)、記憶、情緒、注意力、動(dòng)機(jī)、運(yùn)動(dòng)控制等生理過程，并與帕金森病、成癮、精神分裂癥、多動(dòng)癥和創(chuàng)傷后壓力綜合征等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。實(shí)時(shí)檢測活體內(nèi)特定腦區(qū)的DA信號(hào)變化，有助于更好地理解DA在生理和病理過程中起到的作用。2018年7月12日，李毓龍實(shí)驗(yàn)室在Cell期刊發(fā)表題為“A genetically-encoded fluorescent sensor enables rapid and specific detection of dopamine in flies, fish, and mice”的研究論文。在該研究中，課題組開發(fā)了一種新型、可基因編碼的綠色熒光DA探針GRAB_DA，該探針以環(huán)化重排綠色熒光蛋白（cpEGFP）為基礎(chǔ)，將DA化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)了對DA濃度動(dòng)態(tài)變化的實(shí)時(shí)監(jiān)測。此后該探針的檢測性能在果蠅、斑馬魚和小鼠體內(nèi)得到了充分的驗(yàn)證，表明該探針可作為研究多巴胺能神經(jīng)環(huán)路功能的重要手段。
 

圖3.第一代綠色熒光多巴胺探針的開發(fā)

論文原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.06.042

2020年10月22日，李毓龍實(shí)驗(yàn)室與美國紐約大學(xué)和美國國立衛(wèi)生研究院合作，在Nature Methods期刊上發(fā)表了題為“Next-generation GRAB sensors for monitoring dopaminergic activity in vivo”的研究論文。該研究在第一代綠色熒光DA探針的基礎(chǔ)上，開發(fā)出了新型具有紅色熒光的DA探針（rGRAB_DA1m和rGRAB_DA1h），以便與其它綠色熒光探針進(jìn)行同時(shí)監(jiān)測。此外，該研究還構(gòu)建了具有更高靈敏度以及更高成像信噪比的第二代綠色熒光DA探針（GRAB_DA2m和GRAB_DA2h），與第一代相比，其反應(yīng)幅度提升了2-3倍。
 

圖4.紅色熒光多巴胺探針和第二代綠色熒光多巴胺探針的開發(fā)

論文原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41592-020-00981-9

03 去甲腎SHANG腺素去甲腎SHANG腺素（Norepinephrine, NE）是一種重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)和交感神經(jīng)系統(tǒng)中的多種生理過程，與感覺、學(xué)習(xí)、記憶、注意力、睡眠等行為以及精神疾病和神經(jīng)退行性疾病有關(guān)。因此，實(shí)時(shí)精確監(jiān)測去甲腎SHANG腺素的動(dòng)態(tài)分布，對于研究人員探討NE的生理和病理功能十分關(guān)鍵。2019年3月25日，李毓龍實(shí)驗(yàn)室在Neuron期刊上發(fā)表了題為“A genetically encoded fluorescent sensor for rapid and specific in vivo detection of norepinephrine”的研究論文。該研究首次成功開發(fā)了具有極高的分子特異性和時(shí)空分辨率的、可基因編碼的NE熒光探針（GRAB_NE）�；�于環(huán)化重排綠色熒光蛋白（cpEGFP），該探針可實(shí)時(shí)監(jiān)測體外NE濃度的動(dòng)態(tài)變化情況，并成功在斑馬魚和小鼠體內(nèi)得到驗(yàn)證。此外，具有不同親和力的兩種版本的熒光探針（分別命名為NE1m和NE1h），還可分別用于局部突觸傳遞和非局部非突觸傳遞的NE釋放的檢測。
 

圖5.去甲腎SHANG腺素?zé)晒馓结樄ぷ髟�理和�?yīng)用示意圖

論文原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.neuron.2019.02.037

04 腺苷細(xì)胞外腺苷（adenosine, Ado）在體內(nèi)廣泛的生理過程中發(fā)揮重要作用，包括睡眠-覺醒周期、學(xué)習(xí)記憶、心血管功能和免疫反應(yīng)等。腺苷信號(hào)傳導(dǎo)受損與多種疾病有關(guān)，如疼痛、癲癇、卒中、藥物成癮和神經(jīng)退行性疾病等。在大腦中，腺苷通過激活不同的G蛋白耦聯(lián)的腺苷受體，在突觸水平發(fā)揮神經(jīng)調(diào)節(jié)或穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的作用。盡管腺苷的功能已被廣泛研究，但是由于缺乏能夠精確而又靈敏地檢測體內(nèi)腺苷的方法，其在大腦中的釋放機(jī)制仍不清楚。2020年9月4日，通過與李毓龍實(shí)驗(yàn)室合作，中科院腦智卓越創(chuàng)新中心徐敏研究員課題組在Science期刊上發(fā)表了題為Regulation of sleep homeostasis mediator adenosine by basal forebrain glutamatergic neurons的研究論文。在該研究中，為了檢測睡眠覺醒周期中大腦特定區(qū)域胞外腺苷濃度，李毓龍團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種高靈敏性、高特異性和高時(shí)間分辨率的新型可遺傳編碼的腺苷探針（GRAB_Ado）。利用該探針，結(jié)合光纖記錄、光遺傳學(xué)等技術(shù)，該研究揭示了基底前腦區(qū)域谷氨酸能神經(jīng)元在調(diào)控腺苷動(dòng)態(tài)變化和睡眠穩(wěn)態(tài)中的關(guān)鍵作用，為進(jìn)一步研究睡眠穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
 

圖6.腺苷快速釋放和睡眠穩(wěn)態(tài)的神經(jīng)調(diào)控

論文原文鏈接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.abb0556

05 5-羥色胺5-羥色胺（5-HT）是一種重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織。5-HT可以調(diào)節(jié)進(jìn)食、睡眠、學(xué)習(xí)記憶、情緒、社交等多種行為，而5-HT系統(tǒng)失調(diào)則會(huì)引起多種精神疾病，包括抑郁癥、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙以及成癮等。為進(jìn)一步闡明5-HT的生理功能以及探討其在相關(guān)疾病中的治療意義，李毓龍團(tuán)隊(duì)開展了開發(fā)精確而高時(shí)空分辨監(jiān)測5-HT動(dòng)態(tài)變化方法的工作。2021年4月5日，李毓龍實(shí)驗(yàn)室在Nature Neuroscience期刊上發(fā)表了題為“A genetically encoded sensor for measuring serotonin dynamics”的研究論文。在該研究中，課題組沿用了之前的熒光探針構(gòu)建策略，成功開發(fā)出新型、高靈敏度、高特異性以及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)速率可達(dá)亞秒級(jí)別的5-HT熒光探針（GRAB_5-HT1.0），并且作者還分別在果蠅和小鼠中對探針功能進(jìn)行了檢測，證明5-HT熒光探針具有廣泛應(yīng)用的普適性。

圖7. 5-HT熒光探針的開發(fā)和優(yōu)化

論文原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41593-021-00823-7

06 內(nèi)源DA麻素內(nèi)源DA麻素（endocannabinoids, eCBs）是由神經(jīng)元合成和釋放的一類脂類神經(jīng)調(diào)質(zhì)分子。與經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)的釋放不同，eCBs在突觸后神經(jīng)元釋放，逆行性地作用于突觸前膜DA麻素受體上，發(fā)揮突觸前抑制作用。eCBs參與了大腦多個(gè)區(qū)域的突觸可塑性調(diào)節(jié)以及獎(jiǎng)賞、能量代謝、學(xué)習(xí)記憶、睡眠覺醒等多種生理過程，還和神經(jīng)退行性疾病、癲癇、成癮、抑郁癥等多種疾病密切相關(guān)。2021年11月11日，李毓龍實(shí)驗(yàn)室在Nature Biotechnology期刊上發(fā)表了題為“A fluorescent sensor for spatiotemporally resolved imaging of endocannabinoid dynamics in vivo”的研究論文，在該研究中，課題組采用其先前GRAB探針構(gòu)建策略，首次成功開發(fā)出高時(shí)空分辨率的eCBs熒光探針（GRAB_eCB2.0）。這種新型eCBs熒光探針具有高靈敏度、高選擇性和高動(dòng)力學(xué)特性，可用于檢測體外培養(yǎng)神經(jīng)元、急性腦切片和體內(nèi)特定腦結(jié)構(gòu)在生理和病理活動(dòng)期間的eCBs釋放。
 

圖8.內(nèi)源DA麻素?zé)晒馓结樀拈_發(fā)

論文原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41587-021-01074-4

07 三磷酸腺苷三磷酸腺苷（ATP）等嘌呤類分子廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)外，胞內(nèi)的嘌呤類分子主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝；而胞外的嘌呤類分子則作為信號(hào)分子，參與到睡眠、味覺感受、呼吸調(diào)控等生理活動(dòng)過程。嘌呤能信號(hào)還與抑郁、精神分裂、癲癇、疼痛、炎癥等疾病有關(guān)。2021年12月22日，李毓龍實(shí)驗(yàn)室在Neuron期刊上發(fā)表了題為“A sensitive GRAB sensor for detecting extracellular ATP in vitro and in vivo”的研究論文。該研究沿用先前設(shè)計(jì)的GRAB探針策略，開發(fā)了一種新型、高時(shí)空分辨率且可遺傳編碼的ATP熒光探針（GRAB_ATP1.0），該探針能夠高靈敏度地檢測腦組織中ATP的動(dòng)態(tài)變化，可以實(shí)時(shí)可視化監(jiān)測體外或在體ATP的胞外釋放。
 

圖9. ATP熒光探針的工作原理和應(yīng)用示意圖

論文原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.neuron.2021.11.027

08 催產(chǎn)素催產(chǎn)素（Oxytocin, OT）是哺乳動(dòng)物體內(nèi)分布于內(nèi)分泌系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種十分重要的神經(jīng)肽，在調(diào)節(jié)分娩、哺乳、交配、母嬰關(guān)系和社會(huì)認(rèn)知等行為中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。構(gòu)建高靈敏度、高特異性的分子探針來快速準(zhǔn)確地追蹤其動(dòng)態(tài)變化，對于深入理解催產(chǎn)素的功能以及作用機(jī)理十分關(guān)鍵。2023年1月2日，李毓龍實(shí)驗(yàn)室在Nature Biotechnology期刊上發(fā)表了題為“A genetically encoded sensor measures temporal oxytocin release from different neuronal compartments”的研究論文。在該研究中，團(tuán)隊(duì)沿用已有的GRAB探針策略，成功構(gòu)建出一種新型、高靈敏度、高信噪比、快速響應(yīng)的催產(chǎn)素?zé)晒馓结槪℅RAB_OT1.0）。利用該探針，作者成功在自由活動(dòng)的小鼠中檢測到催產(chǎn)素神經(jīng)元激活引起的催產(chǎn)素釋放，并深入探究了催產(chǎn)素釋放的分子機(jī)制。

圖10.催產(chǎn)素?zé)晒馓结樀拈_發(fā)

論文原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41587-022-01561-2

基于龐大的GPCR家族，李毓龍課題組正在開發(fā)并且得到了更多神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)質(zhì)的多色探針，包括小分子、肽類和脂類等。課題組開發(fā)的工具樂于分享給研究人員使用，歡迎大家聯(lián)系試用，具體可參見：

http://www.yulonglilab.org
 

李毓龍，男，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授，北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、北京大學(xué)-IDG/麥戈文腦科學(xué)研究所研究員，博士生導(dǎo)師、國家杰出青年基金獲得者。課題組致力于開發(fā)新型神經(jīng)成像技術(shù)，用于在時(shí)間和空間尺度上解析神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)雜功能，探究生理及病理?xiàng)l件下突觸傳遞的調(diào)節(jié)機(jī)制。研究成果入選2018年中國生命科學(xué)十大進(jìn)展、2018年中國十大醫(yī)學(xué)科技新聞，曾獲張香桐神經(jīng)科學(xué)青年科學(xué)家獎(jiǎng)、中源協(xié)和生命醫(yī)學(xué)創(chuàng)新突破獎(jiǎng)、首屆“科學(xué)探索獎(jiǎng)”、首屆峰基金支持、談家楨生命科學(xué)獎(jiǎng)、第二十屆吳階平-保羅·楊森醫(yī)學(xué)創(chuàng)新獎(jiǎng)（吳楊獎(jiǎng)）、勃林格殷格翰研究員獎(jiǎng)、教育部基礎(chǔ)學(xué)科拔尖學(xué)生培養(yǎng)計(jì)劃“優(yōu)秀導(dǎo)師獎(jiǎng)”等獎(jiǎng)項(xiàng)。受邀請?jiān)诿绹�神�?jīng)生物協(xié)會(huì)年會(huì)、美國遺傳協(xié)會(huì)果蠅年會(huì)等國際重大會(huì)議做學(xué)術(shù)報(bào)告并撰寫多篇綜述。