本文要點(diǎn)：近紅外二區(qū)(NIR-II, 1000-1700 nm) 熒光成像對(duì)于體內(nèi)深層生物結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確可視化具有巨大潛力。然而，當(dāng)前 NIR-II熒光探針的微弱熒光仍然是對(duì)不斷增長(zhǎng)的成像需求的長(zhǎng)期挑戰(zhàn)。本文通過(guò)將二氧化硅涂層的金納米棒 (GNR) 和聚合物點(diǎn) (Pdots) 結(jié)合到多層納米結(jié)構(gòu)中，實(shí)現(xiàn)表面等離子體增強(qiáng) NIR-II熒光策略，在 NIR-II 成像窗口中實(shí)現(xiàn)了高達(dá) 6.4 的增強(qiáng)因子。表面等離子體增強(qiáng)方法已成功擴(kuò)展到具有 NIR-II發(fā)射的幾種類型的 Pdots 熒光團(tuán)。本文最終對(duì)多層探針進(jìn)行了外層封裝和聚乙二醇化，并展示了表面等離子體增強(qiáng)的 NIR-II熒光，實(shí)現(xiàn)小鼠穿顱腦成像。與臨床批準(zhǔn)的ICG相比，它表現(xiàn)出精細(xì)的信噪比和穿透深度。

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GNR@SiO2-Pdot 納米結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)和制造

Schemem 1 顯示了用于表面等離子增強(qiáng) NIR II熒光的多層納米探針的設(shè)計(jì)策略。作為等離子體材料，GNR 具有顯著的特性：可調(diào)節(jié)的縱向等離子體峰、大的消光截面、良好的化學(xué)穩(wěn)定性和高生物兼容性。大表面積和易于功能化使 GNR 成為生物分子固定化和靶向藥物遞送的理想載體。在這項(xiàng)工作中，作者利用 GNR 的表面等離子共振特性來(lái)增強(qiáng) Pdots 的 NIR-II 熒光。對(duì)于體內(nèi)應(yīng)用，已知藥代動(dòng)力學(xué)和生物分布明顯受粒徑和表面功能化的影響。本文將 GNR 進(jìn)行后續(xù)二氧化硅封裝，目的是通過(guò)調(diào)整二氧化硅殼厚度來(lái)優(yōu)化等離子體增強(qiáng)。首先通過(guò)改進(jìn)的無(wú)核方法制備小型 GNR，并通過(guò)十六烷基三甲基溴化銨 (CTAB) 進(jìn)行穩(wěn)定。對(duì)GNR進(jìn)行了形態(tài)表征（Figure 1A），微型 GNR 可以有效地減小后續(xù)納米探針的最終尺寸和修改過(guò)程，并避免了隨著吸收截面減小而產(chǎn)生的強(qiáng)烈散射，保持了 GNRs 極好的吸收和激發(fā)增強(qiáng)能力。

 

文章選擇半導(dǎo)體聚合物作為 NIR-II熒光發(fā)射模塊，因?yàn)樗鼈兙哂辛己玫墓夥�(wěn)定性和大的吸收截面，有助于制備具有良好重現(xiàn)性和高亮度的 NIR-II納米探針。制備得的 Pdot（m-PBTQ4F）量子產(chǎn)率3.2%，比非氟化對(duì)應(yīng)物亮 3 倍以上。 PSMA是一種兩親性功能聚合物，在 Pdot 制備過(guò)程中引入以產(chǎn)生表面羧基，這使得隨后的靜電組裝成為可能。Pdot在水中分散良好，其平均流體動(dòng)力學(xué)直徑約18 nm（Figure 1B）。 TEM 圖像顯示 Pdot 呈球形。光譜結(jié)果（Figure 1C）表明，Pdots 的熒光光譜擴(kuò)展到 NIR-II 區(qū)域，熒光發(fā)射峰位于 994 和 1120 nm，肩峰位于 1300 nm 以上。此外，GNR 的吸收光譜在 805 nm 附近表現(xiàn)出縱向等離子體峰，同時(shí)與用于 NIR-II成像的 808 nm 激發(fā)光和 Pdot 的吸收峰很好地匹配。

 

已經(jīng)證明，當(dāng)熒光團(tuán)直接與等離子體納米粒子接觸時(shí)，非輻射能量通過(guò)激發(fā)熒光團(tuán)的弛豫迅速轉(zhuǎn)變?yōu)楸砻娴入x子體共振；因此可能會(huì)發(fā)生熒光猝滅而不是熒光增強(qiáng)。為了避免熒光猝滅，在 GNR 和 Pdot 之間引入二氧化硅作為間隔層，并且設(shè)計(jì)了GNR@SiO2-Pdot 納米粒子用于 NIR-II熒光增強(qiáng)。

 

首先，與 GNR 結(jié)合的劇毒 CTAB 被生物兼容性 PEG-SH 取代，這不僅有利于體內(nèi)應(yīng)用，而且有利于后續(xù)的二氧化硅涂層。配體交換過(guò)程不會(huì)改變 GNR 的良好分散性（Figure 1D）。隨后，組裝二氧化硅圖層，其厚度可以通過(guò)改變反應(yīng)時(shí)間和前體濃度來(lái)調(diào)節(jié)。然后，通過(guò)氨基丙基三甲氧基硅烷(APTES) 改性過(guò)程，將GNR@SiO2 納米顆粒與胺基團(tuán)官能化。-NH2質(zhì)子化為GNR@SiO2納米顆粒提供了正電荷，帶負(fù)電的 Pdots 通過(guò)靜電相互作用組裝到帶正電的 GNR@SiO2納米顆粒的表面上。通過(guò)TEM圖像與光譜證實(shí)了 Pdots 通過(guò)靜電相互作用成功組裝到 GNR@SiO2納米顆粒上。

 

GNR@SiO2-Pdots 的表面等離子增強(qiáng) NIR-II 熒光

 

作者研究了GNR@SiO2-Pdot 多層探針中的表面等離子體增強(qiáng) NIR-II熒光。在 808 nm 激光的激發(fā)下測(cè)量熒光發(fā)射光譜。與相同熒光團(tuán)濃度（10 μg mL-1）下的游離 Pdots 相比，GNR@SiO2-Pdots的發(fā)射強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（Figrue 1H）。通過(guò)單獨(dú)比較~1000 nm處的熒光峰強(qiáng)度，增強(qiáng)因子可以增加5倍，揭示了GNR@SiO2-Pdots NIR-II熒光的顯著增強(qiáng)效果。Figure 1E 顯示，與 SiO2納米顆粒混合后，Pdots 熒光強(qiáng)度略有降低；與 CTAB 封端的 GNR（無(wú)二氧化硅殼）混合時(shí)，觀察到到明顯的熒光猝滅。Figure 1I成像結(jié)果清楚地表明只有GNR@SiO2-Pdots 有熒光增強(qiáng)效應(yīng)，與光譜測(cè)量結(jié)果一致。這些觀察結(jié)果證明了二氧化硅間隔層的重要性。

 

GNR@SiO2-Pdots 的距離依賴 NIR-II 熒光增強(qiáng)

 

作者合成了一系列二氧化硅殼厚度不同的GNR@SiO2-Pdot 多層探針。根據(jù)TEM圖像，硅殼的厚度分別為3.7、8.6、11.4和15.3 nm。作為對(duì)照，還制備沒(méi)有二氧化硅層的GNR- Pdots。然后將Pdots組裝到納米顆粒表面，形成具有不同厚度的硅厚度的GNR@SiO2-Pdots。

 

Figure 2D光譜分析表明，在沒(méi)有二氧化硅層的GNR-Pdots中，熒光被猝滅；在二氧化硅厚度為3.7 nm的GNR@SiO2-Pdots中明顯增強(qiáng)。隨著二氧化硅厚度的進(jìn)一步增加，NIR-II發(fā)射在8.6 nm二氧化硅厚度處達(dá)到最佳增強(qiáng)，在11.4和15.3 nm二氧化硅厚度處減弱。結(jié)果一致表明，表面等離子體增強(qiáng)的NIR-II熒光明顯依賴于二氧化硅層的厚度。

 

為了驗(yàn)證等離子體系統(tǒng)增強(qiáng) Pdot 的 NIR-II 熒光的普遍性，制備了具有不同二氧化硅厚度和不同類型 Pdots （p-PBTQ2F、p-PBTQ4F 和 m-PBTQ2F）的多層 GNR@SiO2-Pdots，然后分別進(jìn)行了熒光光譜和 NIR-II 成像的表征（Figure S8 和 S9）。作者將 NIR-II 圖像中 GNR@SiO2-Pdots 相對(duì)于游離 Pdots 的綜合 NIR-II 熒光強(qiáng)度定義為增強(qiáng)因子。Figure 2F 顯示了四種類型的 GNR@SiO2-Pdots 的增強(qiáng)因子隨二氧化硅間隔層厚度的變化趨勢(shì)。結(jié)果表明，隨著二氧化硅厚度的增加，4種類型的納米探針表現(xiàn)出相似的增強(qiáng)趨勢(shì)，在8.6 nm二氧化硅厚度處，p-PBTQ2F、p-PBTQ4F、m-PBTQ2F和m-PBTQ4F Pdots的最佳增強(qiáng)因子分別為6.4、5.8、4.9、3.9。四種類型的Pdots的增強(qiáng)因子不同，可能是由于GNRs的吸收光譜與Pdots的吸收光譜有不同的重疊。四種類型的Pdots的粒徑也略有不同，從而改變了Pdots到GNRs的平均距離。這些因素會(huì)影響最終的熒光增強(qiáng)。

 

用于通過(guò)顱腦成像的表面等離子增強(qiáng) NIR-II 熒光

 

作者將GNR@SiO2- Pdots 探針應(yīng)用于小鼠大腦的顱內(nèi)血管成像。為了提高穩(wěn)定性，GNR@SiO2-Pdots用 PVP 進(jìn)一步穩(wěn)定，然后用外部二氧化硅層封裝，以防止 Pdots 在復(fù)雜的生物環(huán)境中從 GNR@SiO2上解離。已證明用聚（乙二醇）（PEG）密集涂覆納米材料可增加體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。因此，通過(guò)硅烷-PEG在二氧化硅外表面的水解和縮合，GNR@SiO2-Pdots@SiO2被 PEG 功能化。最終探針的熒光光譜形狀類似于GNR@SiO2-Pdots。外層二氧化硅涂層后 NIR-II熒光強(qiáng)度幾乎保持不變，而 PEG 化可以大大改善靜脈注射探針后的血液循環(huán)時(shí)間。

 

使用聚乙二醇化GNR@SiO2-Pdots@SiO2 探針通過(guò)頭皮和顱骨對(duì)小鼠大腦的血管結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像，并與ICG的成像結(jié)果進(jìn)行了比較。前者血管的熒光強(qiáng)度要強(qiáng)得多，復(fù)雜的分支在視覺(jué)上比ICG更清晰，并且來(lái)自血管結(jié)構(gòu)的強(qiáng)熒光信號(hào)在靜脈注射后 2 小時(shí)保持在初始強(qiáng)度的約 80%。這些結(jié)果表明，本文探針憑借其高信噪比和長(zhǎng)保留能力，在 NIR-II熒光成像中優(yōu)于 ICG。最后，評(píng)估了小鼠的全身熒光成像。如Figure 3B所示，整個(gè)小鼠全身的血管結(jié)構(gòu)在仰臥位和俯臥位時(shí)都以高質(zhì)量清晰地成像。當(dāng)鼠標(biāo)處于俯臥位時(shí)，可以清楚地觀察到血管，通過(guò)成像系統(tǒng) SBR 等于 3.1（Figure 3C）。在仰臥位成像時(shí)，后肢血管系統(tǒng)的 SBR 高達(dá) 7.5（Figure 3D）�？傊�，這些成像結(jié)果表明，本文合成的多層探針等離子體增強(qiáng) NIR-II熒光在動(dòng)物研究中具有高對(duì)比度光學(xué)成像的巨大潛力。

 

參考文獻(xiàn)

Peng, L.; Liu, Y.; Zhang, J.; Zhang, Z.; Liu, Z.; Fang, X.; Wang, Y.; Wu, C., Surface Plasmon-Enhanced NIR-II Fluorescence in a Multilayer Nanoprobe for Through-Skull Mouse Brain Imaging. ACS Appl Mater Interfaces 2022, 14 (34), 38575-38583.

 

 

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