期刊： Aging 5.59
測(cè)序技術(shù)：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

導(dǎo)語
胃癌預(yù)后相對(duì)較差。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序能夠在單細(xì)胞水平上對(duì)高度復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞群體進(jìn)行特異性分析，從而揭示了未表征的分子復(fù)雜性。在這項(xiàng)研究中，使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在單細(xì)胞水平上表征了從胃癌患者分離的T細(xì)胞的異質(zhì)性。鑒定了不同的免疫細(xì)胞亞型及其異質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，并描繪了它們的發(fā)育軌跡。特別是對(duì)CD8+細(xì)胞和Tregs，相較于對(duì)照組，來自胃癌組織的CD8+腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL）中的IRF8轉(zhuǎn)錄因子下調(diào)。針對(duì)CD8+耗竭型T細(xì)胞和Treg細(xì)胞進(jìn)行的多種分析為胃癌的免疫治療提供理論基礎(chǔ)。

方法
根據(jù)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)胃癌患者中分離的T細(xì)胞異質(zhì)性，確定了不同的免疫細(xì)胞亞型及其異質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，并對(duì)不同細(xì)胞亞群中的不同基因進(jìn)行分析，為胃癌中免疫細(xì)胞的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

結(jié)果結(jié)論
借助單細(xì)胞測(cè)序?qū)ξ赴┙M織，胃癌患者外周血的免疫細(xì)胞以及對(duì)照組免疫細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，使用UMAP法降維可視化后，根據(jù)特異表達(dá)基因?qū)⒓?xì)胞注釋為特定的免疫細(xì)胞。之后針對(duì)不同的免疫細(xì)胞進(jìn)行差異基因的分析，功能通路分析以及特定基因的分析。這些發(fā)現(xiàn)為胃癌靶向免疫治療提供了理論基礎(chǔ)，可作為研究免疫細(xì)胞基本特征并潛在指導(dǎo)免疫治療。

研究結(jié)果
1. 從胃癌樣品和免疫細(xì)胞聚類中獲取scRNA-seq圖譜
從9個(gè)樣本中分離的免疫細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq，其中包括兩個(gè)健康人的兩個(gè)外周血樣本、三個(gè)胃癌患者術(shù)前的三個(gè)外周血樣本，以及兩對(duì)胃癌組織和癌旁組織樣本。根據(jù)細(xì)胞的分子和功能特點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行分類，確定了組織中的10個(gè)細(xì)胞簇和外周血中的9個(gè)細(xì)胞簇（圖1A）。接下來，確定了每個(gè)免疫細(xì)胞亞型及其異質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子。圖1B顯示了它們的發(fā)展軌跡（圖1B）。同時(shí)確認(rèn)了一些基因的表達(dá)，并分析了其與臨床特征的相關(guān)性（圖1C）
 

2.與正常樣品相比，胃癌樣品中耗竭型CD8+T細(xì)胞中的IRF8下調(diào)
為揭示CD8+T細(xì)胞的內(nèi)在結(jié)構(gòu)和潛在功能亞型，包括初始型，細(xì)胞毒性型和耗竭型CD8+T細(xì)胞，我們分別分析了T與N組和PB與HB組中的基因，并制作了熱圖和火山圖（圖2A、2B）。重點(diǎn)分析了耗竭型CD8+T細(xì)胞在胃癌中的優(yōu)先富集。途徑分析表明，腫瘤浸潤(rùn)耗竭型CD8+T細(xì)胞中的這些不同基因可能參與細(xì)胞因子的產(chǎn)生（圖2C）。在軌跡分支方面，我們觀察到它始于細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞，結(jié)束于胃癌組織中耗竭型CD8+T淋巴細(xì)胞（圖2D），最后以耗竭型CD8+T細(xì)胞在血液中結(jié)束（圖2E），這與腫瘤的正常過程一致。我們?cè)u(píng)估了來自11個(gè)胃癌患者腫瘤的腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+耗竭T細(xì)胞和CD8+TIL中干擾素調(diào)節(jié)因子8（IRF8）轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，IRF8在兩種組織中均下調(diào)（圖2F）。此外，在最初診斷時(shí)分析了32名胃癌患者的外周血單核細(xì)胞（PBMC），以使用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估CD8+T細(xì)胞中的IRF8表達(dá)（圖2G）。根據(jù)癌癥基因組圖譜（TCGA）的胃癌數(shù)據(jù)，IRF8下調(diào)與總生存期（OS）縮短相關(guān)（圖2H）。Open Targets軟件顯示，IRF8在免疫系統(tǒng)的細(xì)胞中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用（圖2I）。
 

5. NK細(xì)胞對(duì)胃癌反應(yīng)時(shí)分泌的更多的抑制性受體和更少的激活性受體
NK細(xì)胞是先天免疫的重要組成部分，由于其釋放細(xì)胞因子的能力和介導(dǎo)對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性，在宿主防御中發(fā)揮關(guān)鍵作用。與相鄰正常組織相比，胃癌組織中IL8、G0S2、HSPA6、CXCL1等上調(diào)，而IGJ、TFF1、NCR2等下調(diào)（圖5A）。在PB與HB組中，SCAF1、LAG3、TPM1等高表達(dá)（圖5B）。途徑分析表明，這些基因可能參與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用、MAPK信號(hào)傳導(dǎo)、趨化因子信號(hào)傳導(dǎo)和T細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)（圖5C，5D）。與對(duì)照組相比，NK細(xì)胞在胃癌組織中表達(dá)了更多的抑制性受體，如KIR2DL2。同樣，與對(duì)照組相比，NK細(xì)胞在胃癌患者血液中表達(dá)較少的活化受體，如KLRK1和CD226。最后，NK細(xì)胞在胃癌中分泌更多的細(xì)胞因子，包括CCL3和CCL4（圖5E，5F）。這些數(shù)據(jù)表明NK細(xì)胞積極參與免疫監(jiān)測(cè)以預(yù)防胃癌。
 

參考文獻(xiàn)：
Single-cell RNA sequencing of immune cells in gastric cancer patients  2020; 12(3): 2747-2763. doi: 10.18632/aging.102774.