文章標(biāo)題：Metabolomic and transcriptomic analyses provide insights into metabolic networks during cashew fruit development and ripening
發(fā)表期刊：Food Chemistry
影響因子：9.231作者單位：海南大學(xué)
百趣生物提供服務(wù)：植物阿趣廣靶®代謝組學(xué)、發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)HD-MIX版

百趣代謝組學(xué)分享—研究背景
腰果樹(shù)(Anacardium occidentale L.)是一種原產(chǎn)于巴西亞馬遜雨林的熱帶常綠喬木。自腰果樹(shù)發(fā)現(xiàn)以來(lái)，便被引入世界各地的熱帶地區(qū)廣泛種植。腰果樹(shù)的果實(shí)有上、下兩部分，上部分呈現(xiàn)梨果狀，是假果，叫“Apple”；下部分呈現(xiàn)腎狀，是真果，叫“Nut”，也就是備受人們歡迎的堅(jiān)果之一——腰果（在后文中，統(tǒng)一稱為“Apple”和“Nut”）。

迄今為止，人們對(duì)“Nut”的研究主要集中在它的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值上。“Nut”富含不飽和脂肪酸，它的脂肪成分中，約60%來(lái)自單不飽和脂肪酸(Monounsaturated Fatty Acid, MUFAs)，20%來(lái)自多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acids, PUFAs)。由于MUFAs和PUFAs可有效調(diào)控總膽固醇和低密度脂蛋白水平，因此食用腰果有助于預(yù)防心血管疾病。而相比“Nut”的高價(jià)值，多汁的“Apple”更像是一種農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品，工業(yè)用途有限，通常被用于果汁加工、濃縮粉生產(chǎn)以及乙醇生產(chǎn)。

果實(shí)發(fā)育和成熟是相互協(xié)調(diào)、精細(xì)調(diào)控的生物學(xué)過(guò)程。代謝組學(xué)分享，盡管前人對(duì)“Nut”以及“Apple”的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，但“Nut”以及“Apple”發(fā)育成熟過(guò)程中的代謝變化和相關(guān)調(diào)控機(jī)制尚不明晰，本研究主要探索腰果發(fā)育周期中代謝是如何變化的，并挖掘轉(zhuǎn)錄調(diào)控的潛在機(jī)制。

2.百趣代謝組學(xué)分享—研究設(shè)計(jì)
腰果樹(shù)的果實(shí)發(fā)育具有很典型的階段性，開(kāi)花后大約一周，腰果花就開(kāi)始發(fā)育成微小的假果，即“Apple”；同時(shí)，綠色的真果“Nut”，也開(kāi)始長(zhǎng)在“Apple”的底端。代謝組學(xué)分享，之后，整個(gè)果實(shí)迅速生長(zhǎng)直至成熟期。基于這樣的特點(diǎn)，作者以時(shí)間為軸線，結(jié)合了代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)來(lái)探索腰果樹(shù)果實(shí)的代謝變化過(guò)程。

作者采集開(kāi)花后15、23、31、39和45天的果實(shí)，分別對(duì)“Apple”和“Nut”取樣，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)應(yīng)這5個(gè)果實(shí)發(fā)育階段，樣本命名為A1-A5(Apple)和N1-N5(Nut)，其研究思路詳見(jiàn)圖1。
 

圖1. 技術(shù)路線圖以及腰果果實(shí)開(kāi)花后“Nut”和“Apple”部位的外觀變化。

3.百趣代謝組學(xué)分享—研究結(jié)果
腰果樹(shù)果實(shí)發(fā)育成熟過(guò)程中的代謝特征
本研究通過(guò)代謝組學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)“Nut”共鑒定出1137個(gè)代謝物，而“Apple”共鑒定出567個(gè)代謝物。從主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)可以看出，“Nut”和“Apple”的代謝物數(shù)據(jù)可以明確分為5組，對(duì)應(yīng)各個(gè)發(fā)育階段，說(shuō)明“Nut”和“Apple”中代謝物的積累與不同發(fā)育階段有著密切的關(guān)系，詳見(jiàn)圖2B。
 

圖2. “Nut”和“Apple”五個(gè)發(fā)育階段的代謝組學(xué)分析。(A)代謝物的數(shù)量和分類；(B)“Nut”和“Apple”代謝組數(shù)據(jù)的主成分分析。N1-N5和A1-A5表示在開(kāi)花后15、23、31、39和45天采集的“Nut”和“Apple”樣本。

腰果樹(shù)果實(shí)發(fā)育階段的脂質(zhì)分析
“Nut”因含有豐富的脂質(zhì)種類而聞名。在本研究中，作者利用脂質(zhì)組學(xué)全面測(cè)定了“Nut”的脂質(zhì)情況。研究發(fā)現(xiàn)，“Nut”中含量最高的脂質(zhì)物質(zhì)為Ethyl dodecanoate。此外，還有161種常見(jiàn)脂質(zhì)，這些脂質(zhì)可分為五大類，即脂肪�；�(Fatty Acyls, FAs)、甘油磷脂(Glycerophospholipids, GPs)、甘油脂(Glycerols, GLs)、糖脂(Sophorolipids, SLs)和鞘脂(Sphingolipids, SPs)。從圖3A可以看出，F(xiàn)As和GPs占總脂類含量的97%以上。

在FAs中，游離脂肪酸(Free Fatty Acid, FFA)是最主要的成分；在GPs中，磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol, PI)和磷脂酰甲醇(PMeOH)的含量最高；在FAs中，飽和脂肪酸(Saturated Fatty Acids, SFAs)的含量高于MUFAs和PUFAs。代謝組學(xué)分享，從圖3B可看出，在“Nut”發(fā)育過(guò)程中，MUFAs是GPs中的優(yōu)勢(shì)組分。從圖3C可看出，在“Nut”發(fā)育過(guò)程中，F(xiàn)FA(16:0)含量相對(duì)穩(wěn)定，F(xiàn)FA(18:1)和FFA(18:2)含量逐漸降低，PI(16:0/18:2)的含量下降，而PI(18:1/18:1)和PMeOH含量明顯上升。
 

圖3. “Nut”五個(gè)發(fā)育階段的脂體組分析。(A)不同脂質(zhì)家族和種類的含量；(B)FAs和GPs的分布，Bars表示標(biāo)準(zhǔn)差；(C)FAs和GPs中優(yōu)勢(shì)組分的相對(duì)含量。

果實(shí)從發(fā)育到成熟過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄組分析
在轉(zhuǎn)錄組分析中，作者將TPM(Transcripts Per Million)>0的基因定義為表達(dá)基因，將絕對(duì)值Log2（TPM的差異倍數(shù)）>1的基因定義為差異表達(dá)基因。代謝組學(xué)分享，經(jīng)分析，“Nut”中的基因表達(dá)量是36911個(gè)，其中有24017個(gè)基因在至少兩組樣本中為差異表達(dá)基因；而“Apple”的基因表達(dá)量為37624個(gè)，其中有17647個(gè)在至少兩組樣本中為差異表達(dá)基因。

作者進(jìn)一步進(jìn)行Z-Score歸一化表達(dá)分析，Z-score值熱圖（圖4A）顯示，“Nut”和“Apple”的基因表達(dá)模式與果實(shí)發(fā)育階段息息相關(guān)。PCA（圖4B）結(jié)果中，N1和A1比較接近，表明在果實(shí)發(fā)育早期，“Nut”和“Apple”具有相似的轉(zhuǎn)錄模式；而到了果實(shí)成熟階段，“Nut”和“Apple”有顯著的差異。綜上說(shuō)明，腰果樹(shù)的基因表達(dá)模式具有組織和發(fā)育階段的特異性。

代謝組和轉(zhuǎn)錄組在不同階段的簇中共同調(diào)控
為了進(jìn)一步揭示腰果果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的代謝變化，通過(guò)K-means聚類分析（圖4C和4D）可知，“Nut”的1137個(gè)代謝物和“Apple”的567個(gè)代謝物分為6個(gè)和5個(gè)聚類簇。在“Nut”中，簇1的代謝物在整個(gè)果實(shí)發(fā)育過(guò)程中逐漸積累，簇2的代謝物在果實(shí)成熟后期富集，簇6的代謝物僅在發(fā)育早期有較高積累，簇2、簇3以及簇5的代謝物在發(fā)育中期積累較多。代謝組學(xué)分享，在“Apple”中，簇2的代謝產(chǎn)物在整個(gè)果實(shí)發(fā)育過(guò)程中逐漸積累，簇3的代謝產(chǎn)物在成熟后期顯著積累，表明其與果實(shí)成熟密切相關(guān)。

為了研究基因表達(dá)與代謝物累積之間的關(guān)系，我們對(duì)代謝組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了共表達(dá)分析。從圖4C可看出，“Nut”中共鑒定出23,980個(gè)與至少一種代謝物共調(diào)控的基因，它們和1137個(gè)代謝物分成6個(gè)共表達(dá)簇。圖4D可看出，在“Apple”中，則鑒定出有20591個(gè)基因與567個(gè)代謝物共調(diào)控，它們分成5個(gè)基因簇。這兩個(gè)組學(xué)的共表達(dá)分析表明，基因的表達(dá)模式與腰果樹(shù)果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的代謝途徑有關(guān)。
 

圖4. 代謝物和基因的轉(zhuǎn)錄組分析和k-Means聚類分析。(A)“Nut”和“Apple”5個(gè)發(fā)育階段表達(dá)層次聚類分析。顏色尺度0-1表示Spearman相關(guān)系數(shù)；(B)轉(zhuǎn)錄組的PCA分析；(C)和(D)k-均值聚類分析代謝物和基因。×軸描述了來(lái)自五個(gè)發(fā)育階段的“Nut”和“Apple”，y軸描述了標(biāo)準(zhǔn)化的每個(gè)代謝物(橙色)和基因(藍(lán)色)的Z-score。每個(gè)方框中顯示的數(shù)字來(lái)自每個(gè)聚類中的代謝物和基因的數(shù)量。N1-N5和A1-A5表示花后15、23、31、39和45d采集的“Nut”和“Apple”樣品。

識(shí)別調(diào)節(jié)PI（Phosphatidylinositols, 磷脂酰肌醇）生物合成的潛在基因和轉(zhuǎn)錄因子
“Nut”中主要的不飽和脂肪酸是GPs，尤其是PIs。作者利用K-Means聚類和KEGG分析，進(jìn)一步挖掘PI的合成途徑的調(diào)控因子。研究發(fā)現(xiàn)17個(gè)屬于簇1的基因在PI的合成通路中富集，包括9個(gè)甘油-3-磷酸�；�轉(zhuǎn)移酶(GPAT)，5個(gè)1-�；�甘油-3-磷酸�；�轉(zhuǎn)移酶(AGPAT)，2個(gè)磷脂�；�轉(zhuǎn)移酶(CDS)和1個(gè)磷脂酰肌醇合成酶(PIS)的編碼基因。

由于“Nut”和“Apple”在果實(shí)發(fā)育早期階段具有相似的轉(zhuǎn)錄模式（圖4B），因此作者只對(duì)N2-N5組進(jìn)行基因表達(dá)分析。

代謝組學(xué)分享，從圖5A可看出，在以上的17個(gè)基因中，大部分基因在“Nut”發(fā)育過(guò)程中逐漸上調(diào)，表明它們參與了PI合成。此外，研究者還鑒定簇1的一個(gè)基因(anoc .0013 s0182)，這個(gè)基因能夠編碼轉(zhuǎn)錄因子WRKY11，而這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子與PI含量密切相關(guān)。進(jìn)一步的分析也表明（圖5B），GPAT和AGPAT的編碼基因與WRKY11具有很強(qiáng)的共表達(dá)。作者還檢測(cè)了GPAT和AGPAT的編碼基因的啟動(dòng)子區(qū)域，確定了W-box的存在，表明WRKY11可能參調(diào)控PI的合成。
 

圖5. “Nut”PI生物合成基因的表達(dá)模式及調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的鑒定。(A)“Nut”PI生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因在5個(gè)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)，基因的表達(dá)水平采用Z-score標(biāo)準(zhǔn)化；(B)通過(guò)注釋的WRKY11與結(jié)構(gòu)基因之間的相關(guān)性構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，每個(gè)基因?qū)Φ募訖?quán)Pearson相關(guān)系數(shù)值用實(shí)線(正)和虛線(負(fù))表示。

鑒定調(diào)控蔗糖代謝的潛在基因和轉(zhuǎn)錄因子
蔗糖等可溶性總固體(Total Soluble Solid, TSS)是果實(shí)成熟的關(guān)鍵指標(biāo)。代謝組分析結(jié)果顯示，成熟的“Apple”中最主要的成分——蔗糖（在簇2代謝物中）在腰果樹(shù)果實(shí)成熟過(guò)程中逐漸積累�；�于此，作者研究了參與蔗糖代謝途徑的潛在的關(guān)鍵基因，在簇2的基因中檢測(cè)到15個(gè)與蔗糖代謝和淀粉水解相關(guān)的關(guān)鍵基因（包括4個(gè)蔗糖雙向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(SWEETS)、2個(gè)轉(zhuǎn)移酶基因(INVS)、3個(gè)蔗糖合成酶基因(SUSS)、1個(gè)果糖激酶基因(Frk)、1個(gè)己糖激酶基因(HXK)、1個(gè)蔗糖磷酸酶基因(SPP)和3個(gè)β-淀粉酶基因(BAM)）。從圖6A可以看出，這15個(gè)基因在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中均逐漸上調(diào)，尤其是在成熟階段高度上調(diào)。

此外，作者從基因簇2中鑒定出19個(gè)與蔗糖代謝密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子（包括4個(gè)MYB，2個(gè)WRKY，2個(gè)乙烯響應(yīng)因子(ERF)、1個(gè)熱激轉(zhuǎn)錄因子(HSF)和7個(gè)與器官發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子），這些轉(zhuǎn)錄因子均與上文參與蔗糖代謝的15個(gè)基因高度相關(guān)（圖S6）。在這19個(gè)轉(zhuǎn)錄因子中，有三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子被注釋為WRKY、ERF和MYB(anoc .0207 s0003、anoc .0002 s0035、anoc .0004 s1381)（圖S5），從圖6B可以看出，它們的表達(dá)隨著果實(shí)的成熟而顯著升高。代謝組學(xué)分享，通過(guò)構(gòu)建并可視化這三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的潛在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖6C），進(jìn)一步證明這三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子與蔗糖相關(guān)基因之間存在高度的連通性，表明它們可能在蔗糖代謝和果實(shí)成熟過(guò)程中發(fā)揮作用。
 

圖6. “Apple”蔗糖代謝基因的表達(dá)模式及調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的鑒定。(A)“Apple”5個(gè)發(fā)育時(shí)期蔗糖代謝相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)模式，基因的表達(dá)水平采用Z - score標(biāo)準(zhǔn)化；(B)鑒定轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)模式；(C) 3個(gè)鑒定的轉(zhuǎn)錄因子(MYB、ERF、WRKY)與蔗糖代謝基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，每個(gè)基因?qū)Φ募訖?quán)Pearson相關(guān)系數(shù)值用實(shí)線（正）和虛線（負(fù)）表示。SPP：蔗糖磷酸酶；SWEET：雙向糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；SUS：蔗糖合成酶；INV：轉(zhuǎn)化酶；FRK：果糖激酶；HXK，己糖激酶；BAM：β -淀粉酶。

4.百趣代謝組學(xué)分享—總結(jié)
本研究基于UHPLC-Q-Exactive-MS的非靶實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)到“Nut”有1137個(gè)代謝物，這些代謝物中，脂質(zhì)可分為5大類，而最主要的脂類是FAs和GPs。代謝組學(xué)分享，除了探討了某些特定脂質(zhì)在發(fā)育過(guò)程的代謝變化外，作者從PI是GPs的主要成分為切入點(diǎn)，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)，通過(guò)分析相同變化趨勢(shì)的代謝物和基因的聚類簇，發(fā)現(xiàn)17個(gè)參與PI合成的基因，還確定了能夠潛在調(diào)控PI合成的轉(zhuǎn)錄因子WRKY11。

基于UHPLC-QTRAP-MS/MS(MRM)的廣靶分析，本研究檢測(cè)到“Apple”有567個(gè)代謝物，TSS是果實(shí)成熟的關(guān)鍵指標(biāo)，作者從成熟的“Apple”最主要的成分——蔗糖為切入點(diǎn)，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過(guò)分析相同變化趨勢(shì)的代謝物和基因的聚類簇，揭示了與糖合成相關(guān)的15個(gè)代謝基因和19個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。

總體而言，該研究在腰果樹(shù)果實(shí)的發(fā)育研究中，引入了代謝網(wǎng)絡(luò)相關(guān)的新視角，為進(jìn)一步研究腰果育種提供了寶貴的資源。
 

圖7. 圖形概要