本文要點(diǎn)：近紅外二區(qū) (NIR-II) 染料可以被外源性或內(nèi)源性白蛋白包裹，形成用于深部組織生物成像的穩(wěn)定復(fù)合物。本文確定了控制花菁染料與白蛋白超分子/共價(jià)結(jié)合的幾個(gè)關(guān)鍵參數(shù)：含Cl的六元環(huán)、小尺寸側(cè)鏈和相對(duì)較高的疏水性。設(shè)計(jì)的熒光團(tuán)(IR-780@albumin) 具有顯著增強(qiáng)的光穩(wěn)定性，可作為 NIR-II生物成像的長(zhǎng)效成像探針。本文研究表明，含氯花菁染料（例如 IR-780）可以更有效地嵌入白蛋白中，從而產(chǎn)生更穩(wěn)定的熒光探針。這一發(fā)現(xiàn)部分解決了臨床上可用的花菁染料的光漂白問(wèn)題，豐富了 NIR-II生物成像和手術(shù)導(dǎo)航的探針庫(kù)。

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先前研究已經(jīng)證明了含氯花菁染料和白蛋白之間通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合。然而，目前仍然缺乏對(duì)結(jié)合機(jī)制的詳細(xì)研究來(lái)指導(dǎo)穩(wěn)定探針的形成。

 

作者首先篩選了一個(gè)與白蛋白結(jié)合的花菁染料庫(kù)，并在測(cè)試了亮度增強(qiáng)效應(yīng)。如Figure 1B所示，通過(guò)比較在DMSO、PBS和BSA中的9種染料的亮度，發(fā)現(xiàn)花菁染料@BSA與在DMSO中相比可以恢復(fù)部分亮度，而在PBS中由于ACQ效應(yīng)而聚集淬滅。IR-783@BSA、IR-808@BSA和 IR-780@BSA與其他染料相比具有更高的熒光增強(qiáng)（Figure 1C）。接著優(yōu)化了染料和 BSA 的摩爾比，1：1結(jié)合有最佳的亮度增強(qiáng)效果（Figure 1D）。IR-780@BSA 光穩(wěn)定性顯著提高，在 NIR-II窗口下半衰期超過(guò)25 min （Figure 1E）。IR-780@BSA 的紅移和熒光增強(qiáng)可能是受限扭曲分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(TICT)的影響（Figure 1F&G）。

 

高濃度的花菁染料@BSA對(duì)激光的耐受性更高（Figure 2A&B），其中IR-780@BSA在所有反應(yīng)濃度下都比IR-783@BSA更穩(wěn)定。作者進(jìn)一步選擇了三種組合：花菁:BSA = 1:1（100μM）；花菁:BSA = 2:1（100μM）；花菁:BSA = 1:1（200μM），比較了亮度衰減的時(shí)間點(diǎn)（t）和亮度（B），結(jié)論是光穩(wěn)定性主要由花菁@BSA的濃度決定，過(guò)量的花菁會(huì)淬滅花菁@BSA的亮度并延長(zhǎng)亮度衰減的時(shí)間點(diǎn)。

 

接下來(lái)探索了花菁@BSA體系的光穩(wěn)定性，在模擬血液環(huán)境下，體系濃度為10 ~ 400μM（Figure 2C，Group 1,2）。當(dāng)花菁與蛋白質(zhì)比例小于1時(shí)，PBS和BSA中的光穩(wěn)定性趨勢(shì)相似，表明當(dāng)花菁與BSA完全結(jié)合時(shí)，花菁@BSA熒光團(tuán)不受緩沖液環(huán)境的影響（Figure 2C，中間）。摩爾比>1的花菁@BSA體系中，游離花菁可以淬滅熒光團(tuán)亮度，而純花菁@BSA可以保持初始亮度（Figure 2C，右）。因此，BSA緩沖液可以通過(guò)與游離花菁結(jié)合而提高花菁@BSA體系（摩爾比 >1）的亮度。

 

稀釋后（Group 1）和10μM 花菁@BSA體系（Group 3）之間的相似趨勢(shì)證明，濃度可以影響光穩(wěn)定性但不改變結(jié)合性質(zhì)。對(duì)于摩爾比>1的花菁@BSA體系，BSA緩沖液稀釋（Group 2）比PBS（Group 1）以及10μM反應(yīng)體系（Group 3）中更具光穩(wěn)定性。此外，IR-780在不同濃度BSA中的吸收和發(fā)射光譜表明，亮度主要由IR-780和BSA之間的相互作用主導(dǎo)。雖然峰值發(fā)射（800−850 nm）隨著BSA的增加而增加，但當(dāng)BSA:IR-780 > 1時(shí)，超過(guò)850 nm的尾部發(fā)射強(qiáng)度是等效的（Figure 2D）。作者還比較了高濃度 (400μM)花菁@BSA被PBS稀釋前后的亮度（Figure 2E）。

 

進(jìn)一步研究了IR-780/IR-783與BSA結(jié)構(gòu)域 I (DI)、結(jié)構(gòu)域 II (DII) 和結(jié)構(gòu)域 III (DIII) 之間的結(jié)合能力。Figure 3A&C所示，花菁@DIII比花菁@DI和花菁@DII亮得多。從電泳結(jié)果 (Figure 3B, D) 來(lái)看, DI和DIII都可以有效地與花菁染料形成共價(jià)鍵。室溫下在較短的反應(yīng)時(shí)間里，含氯化物的花菁染料也可以與 DIII 共價(jià)結(jié)合，而與DI共價(jià)結(jié)合需要更長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間。然而，共價(jià)結(jié)合并沒有提高染料@DI的亮度。從光譜數(shù)據(jù)（Figure 1F、G ）來(lái)看，DI和DIII表現(xiàn)出與BSA相同的促進(jìn)吸收峰紅移的效果，但只有DIII同時(shí)增強(qiáng)了吸收和發(fā)射強(qiáng)度。

 

為了準(zhǔn)確理解花菁與白蛋白或白蛋白片段之間的作用機(jī)制，作者利用商業(yè)化花菁染料（ICG, IRdye800CW, IR-775, IR-780, IR-783, IR-797, IR-806, IR-808, and IR-820）系統(tǒng)分析。比較九組花菁@蛋白的亮度數(shù)據(jù)（Figure 4A），亮度的增強(qiáng)并不依賴共價(jià)結(jié)合。Figure 4C表明DIII是主要的結(jié)合位點(diǎn)，DI使第二結(jié)合位點(diǎn)。花菁與蛋白之間有效的超分子作用的對(duì)于穩(wěn)定TICT至關(guān)重要，因此增量了NIR-II亮度。Figure 4B電泳分析結(jié)果表明，含氯環(huán)己烯基團(tuán)的花菁（IR-775, IR-780, IR-783, IR-808）和BSA，HAS，DIII有完整的相互作用，而IR-820是個(gè)特例。因此，作者合理推測(cè)萘的空間位阻阻擋了IR-820與血清蛋白之間的接觸，從而降低了有限時(shí)間內(nèi)共價(jià)結(jié)合程度。IR-820與DIII的相互作用程度較高證實(shí)了這一假設(shè)。

 

此外，電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)不含Cl的染料（IRdye800CW，ICG）沒有觀察到與蛋白的結(jié)合�；�于這一點(diǎn)，作者假設(shè)位阻和親水性阻止了有效的超分子作用。ICG與BSA、HAS結(jié)合后亮度增強(qiáng)，但與結(jié)構(gòu)域結(jié)合沒有明顯變化。這進(jìn)一步表明，整個(gè)白蛋白的疏水口袋對(duì)于錨定含氯和不含氯的染料都是必不可少的，而 DIII 需要共價(jià)結(jié)合才能有效地“鉤住”含氯染料。然后比較了含Cl染料，包括五元環(huán) (IR-797, IR-806) 和六元環(huán) (IR-775, IR-783)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)花菁染料與五元環(huán) (IR-797, IR-806)僅形成部分共價(jià)結(jié)合。

 

作者進(jìn)行了分子對(duì)接，并用長(zhǎng)時(shí)間分子動(dòng)力學(xué)模擬（MD）確認(rèn)了染料與BSA之間理想的結(jié)合模式（Figure 5）。如Figure 5所示，IR-783@BSA與IR-808@BSA的結(jié)合位點(diǎn)相同，但是IR-780@BSA不同，它有一個(gè)更緊的口袋，這意味著更強(qiáng)的結(jié)合。三個(gè)探針的相對(duì)結(jié)合自由能分別是-47.56, -42.13, and -36.14 kcal/mol，這與實(shí)驗(yàn)觀察一致。

 

作者分析了探針的基礎(chǔ)代謝（Figure 6A-D）。靜脈注射IR-780@BSA后，探針快速積累在肝臟，然后在全身分布，隨后糞便排泄，與游離IR-780的肝膽代謝方式相同（Figure 6A&B）。然后評(píng)估了IR-780@DI和IR-780@DIII的體內(nèi)行為。由于尺寸較小，這兩種結(jié)構(gòu)域衍生的探針都表現(xiàn)出腎臟排泄途徑（Figure 6C、D）。盡管 IR-780@DI和IR-780@DIII給藥小鼠的腎臟信號(hào)沒有太大差異，但I(xiàn)R-780@DIII 的腎臟與皮膚比值在24~96 h內(nèi)更為顯著（Figure 6F）。隨后追蹤了不同花菁@BSA的體內(nèi)行為，并證明探針的代謝行為與共價(jià)鍵合的程度有關(guān)。不含Cl 花菁@血清蛋白顯示出快速的肝膽消除，與游離染料類似。含Cl 花菁@血清蛋白的代謝時(shí)間與光穩(wěn)定性結(jié)果一致（Figure 6B）。體內(nèi)代謝行為可以間接反映花菁@BSA的光穩(wěn)定性特征。

 

最后進(jìn)行淋巴結(jié)成像以評(píng)估NIR-II成像能力。使用三種花菁@BSA（IR-780@BSA，IR-808@BSA，IR-783@ BSA）和臨床使用的ICG研究了淋巴結(jié)成像的光穩(wěn)定性。IR-780@BSA在四個(gè)測(cè)試探針中仍然最穩(wěn)定（Figure 6G）。IR-780@BSA（1 mM，25 μL）為腘窩淋巴結(jié)可視化提供了穩(wěn)定的NIR-II成像，并且在長(zhǎng)達(dá)60 min的連續(xù)激光照射中沒有觀察到信號(hào)衰減（Figure 6G）。在左腳掌注射IR-780@BSA以及右側(cè)注射ICG，腘窩和骶骨淋巴結(jié)在俯臥位清晰地勾勒出來(lái)。成像時(shí)間測(cè)試長(zhǎng)達(dá)6小時(shí)（淋巴結(jié)與皮膚比值≥3.6），滿足了長(zhǎng)時(shí)間成像導(dǎo)航手術(shù)（Figure 6H，I）。

 

參考文獻(xiàn)

Bai, L.; Hu, Z.; Han, T.; Wang, Y.; Xu, J.; Jiang, G.; Feng, X.; Sun, B.; Liu, X.; Tian, R.; Sun, H.; Zhang, S.; Chen, X.; Zhu, S., Super-stable cyanine@albumin fluorophore for enhanced NIR-II bioimaging. Theranostics 2022, 12 (10), 4536-4547.

 

 

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