通過Sanger測序，把患童MMP21基因的突變位點和他們的雙親進行對比(圖，1A)。而這三個MMP21的基因突變位點主要分布在3號外顯子和7號外顯子(圖，1B)。在對應(yīng)的氨基酸序列來看，突變的區(qū)域在鋅依賴性MMP催化域(ZnMC_MMP) 和血紅素樣重復序列(HX超家族) (圖，1C)。這些氨基酸取代位點在多種脊椎動物中高度保守，如(圖1D)所示，MMP21蛋白的氨基酸序列比對中使用Clustal X軟件，這也說明突變導致的氨基酸取代可能導致MMP21蛋白功能的改變。為了進一步研究變異的功能效應(yīng)，我們使用SWISS-MODEL構(gòu)建了WT和突變MMP21蛋白的三維結(jié)構(gòu)(圖1E)。
 

2. MMP21的突變不影響其本身的表達
為了進一步探索MMP21突變對其本身表達的影響，本文構(gòu)建了MMP21突變的HEK293T細胞株，除了空白質(zhì)粒載體，還分別構(gòu)建質(zhì)粒：pCMV3-MMP21-mut1 (p.G244E)；pCMV3- MMP21-mut2 (p.L277F)；pCMV3-MMP21-mut3 (p.K487E)。采取單獨突變轉(zhuǎn)染和共轉(zhuǎn)染(WT/mutant=1:1)兩種方式，并進行RT-qPCR檢測，結(jié)果顯示單獨或是共轉(zhuǎn)染的方式都不影響MMP21轉(zhuǎn)錄水平的改變。通過Western blot進行檢測，結(jié)果顯示MMP21突變在蛋白水平也沒有顯著影響，雖然在單獨轉(zhuǎn)染Mut3蛋白有一定的下調(diào)但是統(tǒng)計沒有顯著性差異(p=0.0529)。(圖2)
 

3. 突變的MMP21 mRNA c.731G>A (mut1) 和c.1459A>G (mut3) 未能逆轉(zhuǎn)SB - MO敲低MMP21引起的斑馬魚心環(huán)紊亂

為了研究確定的突變是否影響MMP21蛋白功能及其在左右軸向發(fā)育中的作用，通過SB-MO微注射構(gòu)建了MMP21敲降斑馬魚模型。通過顯微注射構(gòu)建模型，前期還通過不同的濃度做了預實驗，RT-qPCR結(jié)果表明對照MO和SB-MO(splice-blocking Morpholino oligo)的1.0 mM注射濃度下，有效阻斷斑馬魚中MMP21的剪接。(圖3A)。

利用clmc2的反義鏈RNA設(shè)計探針所謂斑馬魚心內(nèi)心管的標記物，通過原位雜交判斷心臟的位置。基于受精孵育48h (48hfp)的胚胎進行對比，發(fā)現(xiàn)WT組或者處理對照組心臟循環(huán)的方向在右方(D-loop)，但是SB-MO組的心臟循環(huán)更多是不正常的狀態(tài)，比如L-loop或者沒有循環(huán)，甚至會出現(xiàn)尾部畸形或者脊柱彎曲。(圖3B)。
 

 

4. WT&Mut1(c.731G>A)和WT&Mut3(c.1459A>G)雜合子MMP21 mRNA不能完全逆轉(zhuǎn) mmp21引起的心環(huán)異常

在MMP21敲降斑馬魚中，再分別顯微注射，wtMMP、Mut1MMP(c.731G>A: p.G244E)、Mut2MMP(c.829C>T: p.L277F)、Mut3MMP(c.1459A>G: p.K487E)對應(yīng)的mRNA,觀察胚胎心臟畸形是否改善。結(jié)果顯示當注射正常wtMMP時候，可以有效減少斑馬魚胚胎畸形的概率(13.63% vs. 2.51%, p<0.0001)。不同的突變體進行對比發(fā)現(xiàn)，Mut1MMP和Mut3MMP的逆轉(zhuǎn)胚胎畸形的效果不如正常wtMMP的結(jié)果,另一方面Mut2的逆轉(zhuǎn)效果比較好，并且和wtMMP的結(jié)果比較接近。(圖4A，B)同時設(shè)計混合共注射分組（WT：mutant mRNAs = 1:1），模擬雜合子的情況，結(jié)果顯示混合后畸形率有了很大的改善，但是仍然高于wtMMP組。(WT&Mut1: 25.06% vs. WT: 13.76%, p<0.0001；WT&Mut3: 22.32% vs. WT: 13.76%, p=0.0008)。這些結(jié)果表明，p.G244E和p.K487E可能具有顯性負效應(yīng)，并增加異常左右模式的易感性。支持它們的功能和臨床相關(guān)性。
 

參考文獻：
Qin XJ, Xu MM, Ye JJ, et al. De novo disruptive heterozygous MMP21 variants are potential predisposing genetic risk factors in Chinese Han heterotaxy children. Hum Genomics. 2022;16(1):41. Published 2022 Sep 19. doi:10.1186/s40246-022-00409-9