上一篇文章帶著大家了解了干細(xì)胞的起源，從受精卵到桑葚胚(modula)再到囊胚階段，以及干細(xì)胞的特性和分類，還有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離提取方法。

那大家知道最容易獲取的間充質(zhì)干細(xì)胞組織是什么嗎？——沒錯(cuò)，它就是臍帶。今天帶大家一文了解臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的來源、優(yōu)勢(shì)以及分離培養(yǎng)等知識(shí)要點(diǎn)。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源于臍帶組織中的一種基質(zhì)膠，名為華通氏膠！英國(guó)的物理學(xué)家和解剖學(xué)家托馬斯·華通氏（Thomas Wharton 1614-1673）于1656年最先在其書內(nèi)描述了該組織，故取他的名字命名。臍帶的解剖結(jié)構(gòu)為2條臍動(dòng)脈、1條臍靜脈和全程包裹著3條臍帶血管的華通氏膠，華通氏膠的重要作用之一是能夠保護(hù)臍帶血管不受外力的機(jī)械性壓迫或扭曲。華通氏膠外觀呈乳白色半透明狀，主要成分為透明質(zhì)酸（hyaluronic acid）和硫酸軟骨素（chondroitin sulfate）。

因其中含有豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞，根據(jù)其來源的組織將這種間充質(zhì)干細(xì)胞即命名為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cell, UCMSC）。
 

臍帶三維結(jié)構(gòu)
（Stem Cells Translational Medicine 2017;6:1620–1630）

UCMSC/GFP鏡下圖

據(jù)悉，2022年國(guó)內(nèi)共有17個(gè)干細(xì)胞類新藥獲得國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心（CDE）臨床試驗(yàn)?zāi)�示許可IND，主要用于乙肝病毒肝硬化、冠心病、強(qiáng)直性脊柱炎、燒傷、狼瘡腎炎、關(guān)節(jié)炎等治療研究。細(xì)胞來源以人骨髓、脂肪、臍帶組織的MSC為主，其中人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)研究占據(jù)半壁江山，可見潛力無限。
 

材料準(zhǔn)備
1.樣本：采集8小時(shí)內(nèi)的臍帶一條，長(zhǎng)度≥5cm，保存溫度4℃。
2.試劑：OriCell^®人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基50mL，OriCell^®PBS 100mL。
3.耗材：50mL無菌采集瓶一個(gè)，50mL離心管5-10個(gè)，10mL移液管4個(gè)，T75培養(yǎng)瓶若干個(gè)。

臍帶處理
1.1 無菌打開臍帶采集瓶，倒掉保存液。
1.2 用OriCell^®PBS清洗臍帶采集瓶中的臍帶，兩遍。
1.3 用鑷子取出臍帶，用OriCell^®PBS洗凈臍帶外周血漬。
1.4 剪掉綁有臍帶綁繩的兩端，中間段臍帶使用有齒鑷和止血鉗去除臍靜脈和臍動(dòng)脈內(nèi)的殘留血液，再次清洗一次，并將臍帶剪成3cm左右長(zhǎng)的小段。
1.5 去除臍帶的1條臍靜脈和2條臍動(dòng)脈，分離出華通氏膠。

注意：
一定要將1條臍靜脈和2條臍動(dòng)脈剔除干凈，撕出的華通氏膠盡量不要帶有靜動(dòng)脈和羊膜組織，否則容易引入雜細(xì)胞，影響UCMSC的后續(xù)純度。

靜動(dòng)脈內(nèi)部和臍帶表面殘留的血液需要洗干凈，同樣目的是避免混入過多紅細(xì)胞在初期吸收過多培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，影響后續(xù)UCMSC的生長(zhǎng)和增殖。

1.6 用彎剪將離心管中華通氏膠剪成2-3mm²大小。
1.7 將華通氏膠轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，用電子天平稱取1g組織塊。
1.8 在組織塊中加入10mL OriCell^®人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基，混勻。
1.9 將其轉(zhuǎn)移到T75培養(yǎng)瓶中，并將組織塊均勻鋪在T75培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。
2.0 將培養(yǎng)瓶放入37℃、5%CO₂、飽和濕度的CO₂培養(yǎng)箱中。

換液及傳代培養(yǎng)
換液操作
3.1 完成臍帶原代處理后第5天，進(jìn)行第一次換液。
3.2 盡量在不影響組織塊貼壁的情況下，回收培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液和未貼壁的組織塊。
3.3 回收組織塊和舊的培養(yǎng)基經(jīng)過250×g，6min離心后，倒掉上清液。
3.4 重新加入10mL OriCell^®人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基，重新接種于T75培養(yǎng)瓶。

注意：全程都要?jiǎng)幼鬏p柔，盡量不影響貼壁組織塊的貼壁。
3.5 完成第一次換液后第7天，細(xì)胞第二次半換液(可以根據(jù)生長(zhǎng)情況適當(dāng)調(diào)整)。
3.6 盡量在不影響組織塊貼壁的情況下，用10mL移液管回收培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的半量培養(yǎng)液。
3.7 重新加入5mL OriCell^®人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基于T75培養(yǎng)瓶中。
3.8 完成第二次換液后每隔3天進(jìn)行半換液一次，直到細(xì)胞可以進(jìn)行傳代。

P0→P1的傳代培養(yǎng)操作
4.1 確認(rèn)可以進(jìn)行細(xì)胞傳代后，去除漂浮和大塊的組織塊。合并回收培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的組織塊和細(xì)胞培養(yǎng)液。
4.2 經(jīng)600×g，離心5min，收集上清液。
4.3 培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞使用OriCell^®PBS涮洗殘留的培養(yǎng)基后，T75培養(yǎng)瓶加入3mL OriCell^®0.25%胰蛋白酶，消化貼壁細(xì)胞。
4.4 消化完成后按T75培養(yǎng)瓶加入之前收集的上清液5mL終止消化，剩余組織塊混合液留離心管中，標(biāo)記，存4℃冰箱備份，直至細(xì)胞完成凍存。
4.5 回收所有細(xì)胞懸液加入OriCell^®PBS至45mL后經(jīng)100μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾收集濾液，250×g，6min離心后棄去上清。
4.6 細(xì)胞沉淀用30mL OriCell^®PBS重懸，取樣300ul左右細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量和活率。
4.7 根據(jù)接種密度要求，吸取需要的細(xì)胞懸液，250×g，6min離心后棄去上清，加入25mL OriCell^®人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基接種于1個(gè)T175培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。
4.8 將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中37℃，5%CO₂條件培養(yǎng)。

P1后傳代的操作
5.1 將完全培養(yǎng)基、PBS、胰酶預(yù)熱至37℃。
5.2 吸去培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)基。用PBS(T25培養(yǎng)瓶加入約3mL，T75培養(yǎng)瓶加入約6mL)洗滌細(xì)胞2次，注意動(dòng)作輕柔，清洗全面，吸去PBS。
5.3 加入胰酶(T25培養(yǎng)瓶加入約1.5mL，T75培養(yǎng)瓶加入約3mL)，迅速鋪勻，保證充分接觸細(xì)胞表面。
5.4 顯微鏡下觀察消化情況，約70%~80%細(xì)胞收縮變圓后，輕拍培養(yǎng)容器外壁，使細(xì)胞脫離培養(yǎng)表面。立即加入完全培養(yǎng)基(T25培養(yǎng)瓶加入約3mL，T75培養(yǎng)瓶加入約6mL)，隨即輕搖培養(yǎng)容器，使培養(yǎng)基和胰酶迅速混勻，終止消化。
5.5 使用吸管或移液管吸取細(xì)胞懸液，吹打培養(yǎng)容器底面數(shù)次，盡可能將細(xì)胞都吹打下來。

注意：吹打動(dòng)作不可劇烈，避免產(chǎn)生大量氣泡，否則可能損傷和損失細(xì)胞。
5.6 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中。用PBS(T25培養(yǎng)瓶加入約3mL，T75培養(yǎng)瓶加入約6mL)洗滌容器1次，收集殘留細(xì)胞。
5.7 收集的所有細(xì)胞懸液以250×g，離心4min。
5.8 離心后去除上清。加入2mL完全培養(yǎng)基，輕柔吹打細(xì)胞沉淀，充分吹散、混勻。將細(xì)胞按(2.5~4)×10⁴個(gè)活細(xì)胞/cm²接種至適宜的培養(yǎng)容器內(nèi)。

注意:
培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于細(xì)胞密度有較高的要求，我們建議有條件且計(jì)數(shù)效率較高的情況下，進(jìn)行手工計(jì)數(shù)，以期獲得精準(zhǔn)的細(xì)胞濃度指導(dǎo)接種；在沒有精確計(jì)數(shù)條件的情況下，按照適宜比例傳代是更好的方法。

通常人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞傳代比例為1:3，72h內(nèi)生長(zhǎng)至可傳代匯合度。請(qǐng)根據(jù)細(xì)胞實(shí)際生長(zhǎng)情況調(diào)整傳代比例。

5.9 搖勻細(xì)胞，放入37℃、5%CO₂、飽和濕度的CO₂培養(yǎng)箱中。
5.10 傳代次日，觀察細(xì)胞狀態(tài)。若發(fā)現(xiàn)較多漂浮細(xì)胞，應(yīng)予以換液。待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%匯合，即需傳代或凍存。

注意：正常情況下人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞每代生長(zhǎng)時(shí)間不超過72h，中途不需要換液。頻繁換液會(huì)破壞構(gòu)建起的細(xì)胞微環(huán)境

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