肌腱是機(jī)械敏感組織，具有高度組織的膠原蛋白結(jié)構(gòu)，連接肌肉和骨骼，并在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中充當(dāng)力傳遞器。肌腱細(xì)胞是肌腱的主要功能細(xì)胞，嵌入膠原纖維束中，通過(guò)感知和響應(yīng)生物力學(xué)信號(hào)，負(fù)責(zé)維持肌腱穩(wěn)態(tài)和生物力學(xué)特性。

Tenomodulin（Tnmd，腱調(diào)蛋白）是一種II型跨膜糖蛋白，已被確定為肌腱成熟特異分子標(biāo)志，在干細(xì)胞/祖細(xì)胞（TSPC）增殖、分化和衰老中起重要作用。Tnmd缺失的TSPCs也被證明表現(xiàn)出嚴(yán)重的遷移缺陷。此外，Tnmd已被確定為在發(fā)育和成年肌腱中誘導(dǎo)的機(jī)械敏感基因，其在肌腱中的表達(dá)與力強(qiáng)度相關(guān)。

細(xì)胞質(zhì)中生物力學(xué)信號(hào)的感知和翻譯高度依賴于細(xì)胞骨架。特別是，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架在對(duì)機(jī)械刺激產(chǎn)生協(xié)調(diào)和定向的細(xì)胞反應(yīng)中起著機(jī)械調(diào)節(jié)作用。此外，有研究表明，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架介導(dǎo)的染色質(zhì)組織參與了力誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，但該通路是否參與調(diào)節(jié)生物力學(xué)誘導(dǎo)的Tnmd表達(dá)還有待證明。

重慶大學(xué)生物流變科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、重慶郵電大學(xué)生物信息學(xué)院的一項(xiàng)研究探討了循環(huán)機(jī)械拉伸對(duì)Tnmd表達(dá)的影響，揭示了Tnmd在拉伸誘導(dǎo)的肌腱細(xì)胞遷移中的作用。此外還探索了導(dǎo)致Tnmd表達(dá)和肌腱細(xì)胞遷移的潛在機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，重點(diǎn)是肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架介導(dǎo)的染色質(zhì)組織。
 
機(jī)械拉伸誘導(dǎo)肌腱細(xì)胞中Tnmd表達(dá)和細(xì)胞遷移

為了確認(rèn)Tnmd在肌腱組織和細(xì)胞中的表達(dá)，對(duì)Tnmd進(jìn)行mRNA和蛋白質(zhì)分析，與肌腱組織相比，培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞中的Tnmd顯著降低（圖1 A、B）。接下來(lái)，分析Tnmd在加載單軸循環(huán)拉伸（10%，0.5Hz，1小時(shí)）的肌腱細(xì)胞中的基因和蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，與未拉伸的肌腱細(xì)胞相比，Tnmd在mRNA（圖1 C）和蛋白質(zhì)（圖1 D、E）處的表達(dá)水平較高。此外，檢測(cè)機(jī)械拉伸下肌腱細(xì)胞的遷移行為。數(shù)據(jù)顯示，負(fù)載的肌腱細(xì)胞遷移顯著增加（圖1 F、G）。這些結(jié)果可推斷機(jī)械拉伸誘導(dǎo)的Tnmd表達(dá)與肌腱細(xì)胞遷移之間可能存在關(guān)聯(lián)。
  圖1 拉伸上調(diào)培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞中Tnmd表達(dá)和細(xì)胞遷移。
（A）RT-qPCR檢測(cè)TnmdmRNA表達(dá)水平。（B）免疫印跡檢測(cè)肌腱組織和培養(yǎng)肌腱細(xì)胞中Tnmd蛋白水平。（C-E）分別采用RT-qPCR、WB和免疫熒光分析Tnmd在拉伸的肌腱細(xì)胞中的基因和蛋白表達(dá)。（F）測(cè)定遷移性肌腱細(xì)胞。（G）對(duì)遷移率進(jìn)行了量化。

拉伸增加的Tnmd調(diào)節(jié)肌腱細(xì)胞的遷移

為了進(jìn)一步研究Tnmd是否可以直接調(diào)節(jié)肌腱細(xì)胞遷移，實(shí)驗(yàn)利用sh-RNA敲低Tnmd后測(cè)定肌腱細(xì)胞的遷移能力。與對(duì)照沉默組（pLKO.1）相比，Tnmd敲低組（sh-Tnmd1和sh-Tnmd2）Tnmd的mRNA和蛋白顯著降低（圖2 A、B）。此外，拉伸刺激的肌腱細(xì)胞組表現(xiàn)出比機(jī)械拉伸刺激的Tnmd敲低肌腱細(xì)胞組更高的Tnmd表達(dá)（圖2 C、D）。而且暴露于機(jī)械拉伸刺激的Tnmd敲低肌腱細(xì)胞組中肌腱細(xì)胞的遷移也顯著減少（圖2 E、F）。這些發(fā)現(xiàn)表明，肌腱細(xì)胞將機(jī)械力轉(zhuǎn)化為促進(jìn)肌腱細(xì)胞遷移的Tnmd信號(hào)。
  （A、B）RT-qPCR和WB檢測(cè)TnmdmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。肌腱細(xì)胞被表示為“pLKO.1”，并感染慢病毒-shcontrol。肌腱細(xì)胞被表示為“sh-Tnmd”并干擾靶向Tnmd的慢病毒。使用兩個(gè)獨(dú)立的TnmdshRNA，分別表示為sh-Tnmd1和sh-Tnmd2。（C、D）通過(guò)WB檢測(cè)Tnmd和GAPDH（拉伸對(duì)照）的蛋白表達(dá)。（E）檢測(cè)遷移性肌腱細(xì)胞。（F）對(duì)遷移進(jìn)行計(jì)數(shù)和量化。

拉伸增強(qiáng)的肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維增加Tnmd表達(dá)和肌腱細(xì)胞遷移

肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的快速機(jī)械信號(hào)傳遞至關(guān)重要。為了探索肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架在拉伸誘導(dǎo)的Tnmd和肌腱細(xì)胞遷移中的可能作用，實(shí)驗(yàn)評(píng)估了機(jī)械拉伸對(duì)F-肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織的響應(yīng)。與未拉伸組相比，拉伸的肌腱細(xì)胞表現(xiàn)出增厚的肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維（圖3 A、B）。為進(jìn)一步研究肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維對(duì)拉伸誘導(dǎo)的Tnmd表達(dá)和肌腱細(xì)胞遷移的影響，用抑制肌動(dòng)蛋白聚集藥物L(fēng)atA（0.5μM）預(yù)孵育后檢測(cè)Tnmd表達(dá)和肌腱細(xì)胞遷移，LatA可以有效破壞肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維的形成（圖3 C、D）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與沒有LatA的拉伸肌腱細(xì)胞相比，在LatA存在下暴露于拉伸的肌腱細(xì)胞表現(xiàn)出較低的Tnmd表達(dá)。此外，在受拉伸的細(xì)胞中，肌腱細(xì)胞遷移增加，而在LatA存在下拉伸的細(xì)胞顯示肌腱細(xì)胞遷移顯著減少（圖3 F、G）。

此外，考慮到Rho相關(guān)的卷曲蛋白激酶（ROCK）是肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維的特異性因子，因此評(píng)估了ROCK抑制劑Y27632對(duì)拉伸增加的Tnmd表達(dá)和肌腱細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果表明，使用Y27632抑制肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維可消除拉伸誘導(dǎo)的Tnmd表達(dá)和肌腱細(xì)胞遷移。這些結(jié)果表明，肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維對(duì)于誘導(dǎo)拉伸細(xì)胞中的Tnmd表達(dá)和肌腱細(xì)胞遷移很重要。
  （A、C）通過(guò)鬼筆環(huán)肽染色檢測(cè)F-肌動(dòng)蛋白組織，用DAPI（藍(lán)色）對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。右列是左側(cè)原始圖像綠色邊框的部分放大視圖。（B、D）用應(yīng)力纖維增厚（SFTI）評(píng)估和量化F-肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重塑。（E）WB用于分析Tnmd蛋白的表達(dá)。（F）檢測(cè)遷移性肌腱細(xì)胞。（G）對(duì)遷移進(jìn)行計(jì)數(shù)和量化。

拉伸誘導(dǎo)的染色質(zhì)解聚增加Tnmd表達(dá)和肌腱細(xì)胞遷移

為了確定染色質(zhì)組織是否由機(jī)械刺激介導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)評(píng)估了拉伸細(xì)胞中染色質(zhì)凝聚的狀態(tài)。DNaseI敏感位點(diǎn)（DHS）具有可接近染色質(zhì)特征。結(jié)果表明，在沒有DNaseI（脫氧核糖核酸酶I）的情況下進(jìn)行拉伸的細(xì)胞的核區(qū)域與未拉伸組的細(xì)胞核區(qū)域沒有區(qū)別（圖4 A、B）。然而，DNaseI處理導(dǎo)致拉伸細(xì)胞中的核面積比未拉伸的細(xì)胞�。▓D4 A、B），表明機(jī)械拉伸導(dǎo)致染色質(zhì)解聚。

接下來(lái)，確定了染色質(zhì)解聚是否與拉伸誘導(dǎo)的Tnmd表達(dá)和遷移有關(guān)。兩種特異性藥物組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑（ANA）和去甲基化酶抑制劑（GSK-J4）用于抑制染色質(zhì)解聚。結(jié)果表明，與沒有抑制劑的拉伸細(xì)胞相比，ANA或GSK-J4處理的拉伸肌腱細(xì)胞中染色質(zhì)凝聚增加（圖4 C、D）。

為了確定處于凝縮狀態(tài)的染色質(zhì)對(duì)拉伸誘導(dǎo)的Tnmd表達(dá)和肌腱細(xì)胞遷移的影響，將肌腱細(xì)胞與ANA或GSK-J4預(yù)孵育1h，然后用拉伸刺激。結(jié)果表明，在染色質(zhì)解聚抑制劑ANA和GSK-J4存在下暴露于拉伸的肌腱細(xì)胞在mRNA水平上Tnmd的表達(dá)較低（圖4 E）。此外發(fā)現(xiàn)，與拉伸的肌腱細(xì)胞相比，在ANA處理的拉伸細(xì)胞或GSK-J4處理的拉伸細(xì)胞中，Tnmd蛋白表達(dá)和肌腱細(xì)胞遷移被消除（圖4 F-H）。這些結(jié)果表明，組蛋白甲基化和乙�；�引起的染色質(zhì)解聚可能有助于拉伸誘導(dǎo)的Tnmd表達(dá)和肌腱細(xì)胞遷移。
  圖4 解凝染色質(zhì)有助于拉伸肌腱細(xì)胞中的Tnmd表達(dá)和腱細(xì)胞遷移。
（A、C）通過(guò)原位DNaseI靈敏度檢測(cè)染色質(zhì)凝聚。（B、D）用核面積評(píng)估和量化染色質(zhì)凝聚的程度。（E）TnmdmRNA表達(dá)的RT-qPCR檢測(cè)。（F）WB用于分析Tnmd蛋白的表達(dá)。（G）檢測(cè)遷移性肌腱細(xì)胞。（H）對(duì)遷移進(jìn)行計(jì)數(shù)和量化。

綜上所述，該研究結(jié)果表明，肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維的形成和染色質(zhì)解聚可調(diào)節(jié)Tnmd表達(dá)，從而可能調(diào)節(jié)肌腱細(xì)胞遷移。因此，該研究提出了肌動(dòng)蛋白和染色質(zhì)機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與Tnmd調(diào)控，并揭示了Tnmd在肌腱細(xì)胞遷移中的新作用。Tnmd在肌腱細(xì)胞遷移中的功能鑒定為Tnmd介導(dǎo)的肌腱修復(fù)所涉及的分子機(jī)制提供了見解。

參考文獻(xiàn)：Xu P, Deng B, Zhang B, Luo Q, Song G. Stretch-Induced Tenomodulin Expression Promotes Tenocyte Migration via F-Actin and Chromatin Remodeling. Int J Mol Sci. 2021 May 6;22(9):4928. doi: 10.3390/ijms22094928. PMID: 34066472; PMCID: PMC8124537.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34066472/

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