機(jī)械力學(xué)信號(hào)對(duì)骨量調(diào)節(jié)、骨穩(wěn)態(tài)和骨骼適應(yīng)有深遠(yuǎn)影響。通常，機(jī)械力傳遞到骨組織，并由機(jī)械敏感細(xì)胞（骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及其祖細(xì)胞）感知，通過(guò)細(xì)胞增殖、分化和凋亡導(dǎo)致成骨。許多體外研究證實(shí)，成骨細(xì)胞對(duì)各種不同的剪切應(yīng)力（FSS）都有敏感反應(yīng)，其中最常用的范圍為0.5-2Pa。迄今為止，F(xiàn)SS對(duì)骨重塑的影響已受到廣泛關(guān)注，但對(duì)其潛在的分子機(jī)制知之甚少，例如FSS如何與其他過(guò)程（包括自噬）整合，從而極大地促進(jìn)骨重塑以刺激成骨細(xì)胞的分化。

膜聯(lián)蛋白A（AnxA）是一個(gè)鈣離子依賴(lài)的磷脂結(jié)合蛋白家族，參與細(xì)胞膜的組成、胞吞、胞吐、離子通道調(diào)節(jié)、離子通道活性、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞膜與細(xì)胞骨架的連接等。研究表明，成骨細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中AnxA6的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致一些病理過(guò)程，例如骨質(zhì)疏松癥和動(dòng)脈粥樣硬化。此外，AnxA6通過(guò)調(diào)節(jié)囊泡脂膜的形成和促進(jìn)細(xì)胞胞吐作用來(lái)促進(jìn)自噬過(guò)程。膜聯(lián)蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)和分布對(duì)機(jī)械微環(huán)境的變化高度敏感，尤其是流體流動(dòng)，而AnxA6在FSS介導(dǎo)的成骨細(xì)胞礦化中的作用尚不清楚。
鑒于自噬在成骨細(xì)胞增殖和分化中的作用，以及AnxA6參與自噬過(guò)程，在四川華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究室的一項(xiàng)研究中，闡明了AnxA6調(diào)節(jié)的自噬在FSS介導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化中的作用。
FSS誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化

為了研究FSS對(duì)骨形成的影響，首先探討了FSS如何影響機(jī)械力學(xué)敏感細(xì)胞MC3T3-E1（小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞系）的成骨分化。不同強(qiáng)度的FSS，分別為0（靜態(tài)對(duì)照）、5、10和20dyn/cm2，應(yīng)用于MC3T3-E1細(xì)胞1h。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，F(xiàn)SS顯著促進(jìn)成骨標(biāo)志物ColI和ALP的表達(dá)（圖1A、B）。隨著FSS強(qiáng)度的增加，ColI表達(dá)上調(diào)，在20dyn/cm2組中觀察到較高表達(dá)，而ALP的表達(dá)在10dyn/cm2的條件下較高。

為了優(yōu)化FSS對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響，在FSS強(qiáng)度為10dyn/cm2的情況下，對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞施加0（靜態(tài)對(duì)照）、0.5、1、2、4h不同的加載時(shí)間。結(jié)果顯示，10dyn/cm2FSS的強(qiáng)度引起成骨分化相關(guān)基因Runx2、ALP和ColI的表達(dá)，在1h后增加到較高水平（圖1C、D）。此外，分別對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行ALP染色和ALP活性監(jiān)測(cè)，以進(jìn)一步探討FSS對(duì)成骨分化的影響。如圖1E、F，與靜態(tài)組相比，暴露于10dyn/cm21h時(shí)ALP陽(yáng)性細(xì)胞增加了1.8倍。ALP活性也表現(xiàn)出3.6倍的顯著增強(qiáng)（圖1G）。

這些結(jié)果表明，10dyn/cm2強(qiáng)度的FSS持續(xù)1h有利于MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化。
FSS促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞中AnxA6的表達(dá)

為了研究AnxA6對(duì)FSS的響應(yīng)，對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞施加0，5，10和20dyn/cm2的FSS1h。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)定，AnxA6在5和10dyn/cm2下表達(dá)顯著升高，但暴露于20dyn/cm2時(shí)明顯下降（圖2A、B）。

為進(jìn)一步探討FSS加載持續(xù)時(shí)間對(duì)AnxA6表達(dá)的影響，在強(qiáng)度為10dyn/cm2下的MC3T3-E1細(xì)胞上應(yīng)用0、0.5、1、2和4h的不同加載時(shí)間的FSS。與靜態(tài)組相比，F(xiàn)SS處理1h后AnxA6升高至較高水平，而在處理0.5和4h后，AnxA6表達(dá)下降（圖2C、D）。MC3T3-E1細(xì)胞用10dyn/cm2的FSS處理1h后，AnxA6的免疫熒光強(qiáng)度升高（圖2E）。

這些結(jié)果表明，10dyn/cm2強(qiáng)度的FSS持續(xù)1h可以促進(jìn)AnxA6的表達(dá)，這與圖1中Runx2、ALP和ColI的表達(dá)一致，表明AnxA6表達(dá)與成骨分化之間存在潛在相關(guān)性。
AnxA6參與FSS誘導(dǎo)的成骨分化

通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定的AnxA6敲低的MC3T3-E1細(xì)胞系，研究AnxA6對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響。在MC3T3-E1細(xì)胞中，AnxA6的缺乏導(dǎo)致礦物沉積減少，ALP陽(yáng)性細(xì)胞減少，ALP活性降低。成骨相關(guān)蛋白ALP和ColI表達(dá)的降低進(jìn)一步證實(shí)了AnxA6缺失對(duì)成骨分化的抑制。為了進(jìn)一步探索AnxA6在FSS調(diào)節(jié)的成骨中的作用，對(duì)shCtrl和shAnxA6MC3T3-E1細(xì)胞施加1h10dyn/cm2的FSS，結(jié)果表明，當(dāng)暴露于10dyn/cm2的FSS1h時(shí)，shAnxA6細(xì)胞中ALP和ColI的表達(dá)恢復(fù)到較高水平，但在相同的FSS負(fù)荷下，仍然不能超過(guò)shCtrl細(xì)胞中的水平。

敲低AnxA6在FSS條件下?lián)p害自噬

接下來(lái)探討了FSS誘導(dǎo)的AnxA6是否會(huì)影響自噬。與靜態(tài)組相比，暴露于5、10和20dyn/cm2的細(xì)胞自噬標(biāo)志物Beclin1、ATG5和ATG7表達(dá)較高，并伴有較多的LC3B-I轉(zhuǎn)化產(chǎn)生大量的LC3B-II，表明自噬流發(fā)生加速。

通過(guò)調(diào)節(jié)FSS持續(xù)時(shí)間進(jìn)一步研究了FSS加載時(shí)間對(duì)自噬的影響。與靜態(tài)對(duì)照相比，10dyn/cm2FSS持續(xù)0.5和1h后MC3T3-E1中Beclin1、ATG5和ATG7的表達(dá)增加，而自溶酶體中可被降解破壞的p62顯著降低。這些結(jié)果表明，10dyn/cm2強(qiáng)度的FSS持續(xù)1h可導(dǎo)致自噬的顯著發(fā)生。

為了揭示AnxA6在FSS誘導(dǎo)的自噬中的作用，應(yīng)用1h10dyn/cm2的FSS到shCtrl和shAnxA6MC3T3-E1細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無(wú)論FSS負(fù)荷如何，在shCtrl組中，Beclin1和ATG5在FSS中顯著增加，而其在AnxA6敲低細(xì)胞中受到極大抑制（圖3A、B）。透射電子顯微鏡（TEM）的結(jié)果與上述蛋白質(zhì)印跡分析呈現(xiàn)相似的趨勢(shì)（圖3C）在shCtrl細(xì)胞中通過(guò)FSS誘導(dǎo)形成更多的自噬體，而AnxA6敲低細(xì)胞顯示出自噬體的數(shù)量減少。此外，暴露于FSS時(shí)細(xì)胞質(zhì)中有更多的LC3B點(diǎn)狀分布，表明自噬流的發(fā)生，盡管敲低AnxA6組阻礙了該過(guò)程（圖3D）。
這些結(jié)果表明，F(xiàn)SS可以通過(guò)誘導(dǎo)AnxA6誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。
 
FSS通過(guò)激活A(yù)nxA6介導(dǎo)的自噬來(lái)促進(jìn)成骨分化

為了進(jìn)一步剖析自噬在成骨分化和基質(zhì)礦化中的作用，實(shí)驗(yàn)在體外礦化過(guò)程中使用自噬抑制劑（氯喹）和自噬激活劑（雷帕霉素）調(diào)控自噬狀態(tài)。用成骨培養(yǎng)基培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞7或14天后，氯喹對(duì)自噬的抑制大大減少了ALP陽(yáng)性染色細(xì)胞的數(shù)量，并抑制了礦化結(jié)節(jié)的形成，而雷帕霉素激活自噬顯示出截然相反的效果，促進(jìn)了礦化過(guò)程（圖4A、B）。此外，氯喹的添加降低了MC3T3-E1細(xì)胞中Beclin1和ATG7的表達(dá)，以及ALP和ColI的表達(dá)。另一方面，雷帕霉素上調(diào)自噬和成骨細(xì)胞分化相關(guān)蛋白表達(dá)（圖4C、D）。這些結(jié)果表明，自噬調(diào)節(jié)引起了成骨細(xì)胞分化和礦化的改變。

最后實(shí)驗(yàn)研究了FSS誘導(dǎo)的AnxA6是否通過(guò)激活自噬來(lái)增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化。由于敲低AnxA6在靜態(tài)和FSS條件下均導(dǎo)致自噬和成骨分化的抑制，因此雷帕霉素用于恢復(fù)AnxA6敲低抑制的自噬流，并隨后檢測(cè)成骨標(biāo)志物的表達(dá)，以確定自噬在此過(guò)程中的影響。如圖4E、F，雷帕霉素的前提條件恢復(fù)了在shAnxA6組中受到抑制的ALP和ColI的表達(dá)，特別是在FSS負(fù)荷條件下。此外，ALP和ColI的表達(dá)與自噬標(biāo)志物（包括Beclin1、ATG5和ATG7）的表達(dá)呈正相關(guān)。

總體而言，F(xiàn)SS通過(guò)AnxA6介導(dǎo)的自噬激活有助于成骨細(xì)胞的分化和礦化。
  MC3T3-E1細(xì)胞對(duì)外部機(jī)械力學(xué)刺激敏感。一旦FSS施加在MC3T3-E1細(xì)胞上，AnxA6就可以直接或與其他機(jī)械傳感器協(xié)同響應(yīng)FSS，伴隨著其從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞膜的易位。隨后，AnxA6表達(dá)升高影響下游自噬流，并進(jìn)一步調(diào)節(jié)成骨分化。

綜上所述，該研究結(jié)果表明，AnxA6調(diào)節(jié)的自噬在FSS誘導(dǎo)的成骨分化中起重要作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1h10dyn/cm2的FSS可提供足量的AnxA6來(lái)啟動(dòng)自噬并增加ALP和ColI表達(dá)，導(dǎo)致成骨分化。AnxA6的敲低強(qiáng)烈抑制自噬，從而降低了成骨分化，而自噬激活劑恢復(fù)的自噬流也可恢復(fù)FSS對(duì)成骨分化的影響。所有這些結(jié)果為FSS誘導(dǎo)的成骨機(jī)制提供了新的見(jiàn)解。

參考文獻(xiàn)：PeiT,SuG,YangJ,GaoW,YangX,ZhangY,RenJ,ShenY,LiuX.FluidShearStress
RegulatesOsteogenicDifferentiationviaAnnexinA6-MediatedAutophagyinMC3T3-E1Cells.IntJMolSci.2022Dec11;23(24):15702.doi:10.3390/ijms232415702.PMID:365
55344;PMCID:PMC9779398.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36555344/
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