期刊：nature communications（17.694）
技術(shù)服務(wù)：scRNA-Seq測序

導(dǎo)語
腫瘤內(nèi)異質(zhì)性作為研究腫瘤分子特征不可回避的話題，腫瘤細(xì)胞的進(jìn)化及腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境（TME）的持續(xù)作用都有可能導(dǎo)致腫瘤異質(zhì)性的出現(xiàn)。由于腫瘤的進(jìn)化伴隨著腫瘤細(xì)胞和TME的持續(xù)相互作用，因此定義細(xì)胞特征及其潛在的分子通信網(wǎng)絡(luò)(它們塑造了腫瘤生態(tài)環(huán)境，從而推動了腫瘤的進(jìn)化)可能是提高對腫瘤生態(tài)系統(tǒng)的分子理解和開發(fā)有效的實體腫瘤治療方法的關(guān)鍵。現(xiàn)有大量研究也表明，腫瘤內(nèi)異質(zhì)性與病人預(yù)后也存在很大的相關(guān)性。

理論假設(shè)
本文作者認(rèn)為，每個腫瘤生態(tài)系統(tǒng)都可能代表了腫瘤細(xì)胞在特定的選擇壓力下促進(jìn)腫瘤進(jìn)化的腫瘤-基質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的獨特組合，因此，腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)/免疫細(xì)胞間的互作代表著該狀態(tài)下腫瘤生物學(xué)的特定指紋特征。這一特征類似描述酶-底物相互作用的鎖-鑰匙模型。

實驗思路
本文作者對七個病人組織樣本進(jìn)行單細(xì)胞測序（4例HCC和3例ICCA），研究惡性細(xì)胞的動態(tài)以及惡性細(xì)胞與腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞間的通訊網(wǎng)絡(luò)，使用額外的25例HCC和12例iCCA患者的scRNAseq數(shù)據(jù)進(jìn)行驗證，并將一些顯著的受配體對在額外收集的542例HCC病人轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中驗證。

設(shè)計亮點：目前大量研究主要依賴于對腫瘤組織單個區(qū)域取樣獲得的活檢樣本，探索其細(xì)胞組成。很可能受到取樣位置的影響。本研究采取對每個病人多區(qū)域取樣做單細(xì)胞檢測降低由于取樣偏差帶來的影響。結(jié)果表明，腫瘤異質(zhì)性明顯存在，但無論腫瘤細(xì)胞組成還是腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境的信息交流的變化腫瘤內(nèi)部的變化小于腫瘤間的變化。

主要結(jié)果
本文共收集七個病人的樣本，每個病人分別取五個位置獲取活檢樣本（分別命名為B、N、T1、T2、T3；其中3CT3樣本建庫失敗），共34個樣本進(jìn)行單細(xì)胞測序。
 

以正常肝組織作為對照，采用inferCNV識別腫瘤惡性細(xì)胞，將檢測到惡性細(xì)胞數(shù)目大于10的樣本納入后續(xù)惡性細(xì)胞分析，共保留來自六個患者（1H、2H、3H、4H、1C、3C）的數(shù)據(jù)，如下：
 

1. 探究腫瘤區(qū)域間異質(zhì)性
對來源于各患者不同區(qū)域腫瘤惡性細(xì)胞t-SNE降維聚類結(jié)果顯示，惡性細(xì)胞傾向于聚成患者特異的cluster，且患者間異質(zhì)性要高于區(qū)域間異質(zhì)性。層次聚類結(jié)果顯示，來源于同一個患者的各區(qū)域腫瘤細(xì)胞傾向于聚在一起，且與腫瘤大小無顯著關(guān)聯(lián)。本文進(jìn)一步比較了來源于同一患者不同腫瘤區(qū)域的組織學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)腫瘤區(qū)域間具有顯著差異。
 

為了進(jìn)一步定量評估區(qū)域內(nèi)的異質(zhì)性，文章計算了同一取樣區(qū)域內(nèi)惡性細(xì)胞間的相關(guān)性，和不同區(qū)域各惡性細(xì)胞間的相關(guān)性，結(jié)果表明同一區(qū)域內(nèi)和來源于同一患者各區(qū)域間的相關(guān)性遠(yuǎn)高于不同患者間相關(guān)性。
 

對上皮細(xì)胞t-SNE降維聚類結(jié)果顯示，惡性細(xì)胞表現(xiàn)出樣本特異性的表達(dá)模式，而來源于不同樣本正常組織的上皮細(xì)胞混在一起，共享相同的表達(dá)模式。
 

文章進(jìn)一步計算了腫瘤核心位置和邊緣位置腫瘤異質(zhì)性比例和腫瘤大小關(guān)系、腫瘤區(qū)域間異質(zhì)性均值和腫瘤大小關(guān)系、腫瘤內(nèi)細(xì)胞間相關(guān)性和腫瘤大小關(guān)系，結(jié)果表明，雖然腫瘤大小和組織學(xué)特征可能在患者之間有所不同，但患者內(nèi)部各腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組活性的差異要比患者之間的差異小得多。
 

為了評估與轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性相關(guān)的不同區(qū)域的惡性細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)，文章進(jìn)行RNA速率分析，并分析與細(xì)胞增殖相關(guān)的四個干性基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明雖然不同干性基因表達(dá)出明顯的異質(zhì)性，但其在惡性細(xì)胞的表達(dá)在腫瘤的不同區(qū)域卻呈現(xiàn)相似的細(xì)胞軌跡。
 

文章采用熒光激活分選的方法（FACS）篩選EPCAM+ 細(xì)胞和 GPC3+ 細(xì)胞，已知這兩種marker在腫瘤細(xì)胞中顯著表達(dá)。結(jié)果顯示EPCAM+或GPC3+細(xì)胞在腫瘤核心區(qū)域的比例相對穩(wěn)定，但與腫瘤邊緣區(qū)域相比存在差異。免疫組化結(jié)果顯示SPP1基因表達(dá)在腫瘤細(xì)胞中顯著升高。
 

2. 識別多區(qū)域間腫瘤-免疫通訊網(wǎng)絡(luò)
文章以CellPhoneDB方法識別惡性細(xì)胞與TME間的受配體互作對，進(jìn)一步探索在患者內(nèi)部多區(qū)域高度保守的病人特異互作網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示，基于分子層面的通訊網(wǎng)絡(luò)在采樣區(qū)域間表現(xiàn)較好的穩(wěn)定性，在病人間展現(xiàn)高度特異性，且在HCC患者中穩(wěn)定性好于ICCA組患者。文章采用隨機(jī)洗牌的方式評估腫瘤細(xì)胞和TME對患者特異性受配體的貢獻(xiàn)率，結(jié)果表明每種腫瘤在腫瘤細(xì)胞和TME之間可能包含相對穩(wěn)定但獨特的通信網(wǎng)絡(luò)，其中惡性細(xì)胞在患者特異性模式中起主導(dǎo)地位。
 

3. 識別與患者臨床特征相關(guān)的分子特征
文章將基于單細(xì)胞數(shù)據(jù)得到受配體對在包含生存數(shù)據(jù)的542HCC三套數(shù)據(jù)集的常規(guī)bulk轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中驗證其與生存相關(guān)性，得到各樣本受配體對表達(dá)圖譜，基于層次聚類結(jié)果顯示，樣本被分為具有不同互作模式的兩組，且兩組腫瘤樣本總體生存期存在顯著差異。文章發(fā)現(xiàn)GALS9-SLC1A5 和SPP1-PTGER4 受配體在三套數(shù)據(jù)集中高度一致且在組內(nèi)特征貢獻(xiàn)較大。進(jìn)一步表明互作網(wǎng)絡(luò)是HCC侵襲性的一個穩(wěn)定特征，類似于鎖-鑰匙特征酶和底物的相互作用的腫瘤-免疫/基質(zhì)相互作用對的獨特組合可以作為腫瘤侵襲性的分類器。
 

為進(jìn)一步驗證受配體相互作用與HCC預(yù)后相關(guān)的穩(wěn)健性，文章采用多重?zé)晒庠�位雜交的方法驗證兩個關(guān)鍵受配體對(LGALS9-SLC1A5 和SPP1-PTGER4) 。結(jié)果顯示受配體對相關(guān)的四個基因共定位于某些特定腫瘤區(qū)域，而非整個腫瘤空間，且來源同一受配體對的基因表達(dá)傾向于一致。兩個受配體對均高表達(dá)的患者總體生存期明顯低于低表達(dá)組，即兩個受配體對穩(wěn)定高表達(dá)的HCC患者表現(xiàn)出較差的預(yù)后。
 

結(jié)論
文章通過多區(qū)域單細(xì)胞測序探究腫瘤各區(qū)域內(nèi)和區(qū)域間異質(zhì)性，進(jìn)一步評估腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境對整個腫瘤生態(tài)貢獻(xiàn)，且識別出與患者預(yù)后顯著相關(guān)的分子特征。本研究揭示了惡性生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定分子網(wǎng)絡(luò)，為惡性生態(tài)系統(tǒng)的治療探索開辟了新的途徑。

參考文獻(xiàn)：
Ma, L., Heinrich, S., Wang, L. et al. Multiregional single-cell dissection of tumor and immune cells reveals stable lock-and-key features in liver cancer. Nat Commun 13, 7533 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-35291-5