初代測序技術(shù)的特點、分類、原理及應用
1977年Sanger和Gilbert分別提出雙脫氧鏈終止法和化學降解法測序法，標志著初代測序技術(shù)的誕生。
初代測序技術(shù)分類
Maxam-Gilbert化學降解法測序
1. 測序原理：先對DNA片段的5＇或3＇端進行放射性標記，再采用特異性化學試劑修飾和裂解特定的堿基位點，從而得到一系列有共同放射起點但長度不一的DNA片段混合物，通過對此混合物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳即可從放射自顯影片直接讀出DNA堿基序列。
2. 堿基序列的識讀：聚丙烯酰胺凝膠電泳可以將DNA片段混合物按片段大小分開，片段越小越接近凝膠底部。因為化學降解反應并非絕對的堿基特異性反應，在識讀時需從A+G泳道中扣除G泳道的條帶而推斷A堿基，從C+T泳道中扣除C泳道的條帶而推斷T堿基，即若A+G泳道中出現(xiàn)一條帶且G泳道中有相同大小的帶，則識讀為G堿基，若G泳道中沒有相同大小的帶，則識讀為A堿基。[1]
在不同點切割相同的DNA標記片段會產(chǎn)生不同大小的標記片段，然后通過凝膠電泳分離片段
但由于化學降解法測序技術(shù)對待測DNA要求較高、操作繁瑣、試劑毒性大、放射性標記率偏低等原因，并未得到廣泛應用。
Sanger雙脫氧鏈終止法測序
1. 測序原理：以待測單鏈DNA為模板，在引物的引導下依據(jù)堿基互補配對的原則，隨機引入底物：4種dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)和4種ddNTP(ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP)。在DNA聚合酶的作用下，若引入dNTP則新生鏈繼續(xù)延伸，若引入ddNTP則新生鏈合成終止。因此反應結(jié)束后體系中得到一系列長度不一的DNA片段混合物，通過電泳對此混合物按分子量大小分開即可讀出DNA堿基序列。
圖2 傳統(tǒng)（a） VS 改進后（b）Sanger法測序原理示意圖
傳統(tǒng)Sanger測序采用放射性核素標記引物，分成4管反應體系，通過平板聚丙烯凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行分離。而改進后的Sanger測序采用熒光素標記標記ddNTP或標記引物，熒光素標記ddNTP時可實現(xiàn)4管反應在同一管中進行，通過毛細管電泳對PCR產(chǎn)物進行分離。
2. 堿基序列的識讀：通過電泳將DNA片段混合物按片段大小分開，傳統(tǒng)Sanger測序利用放射自顯影技術(shù)，人工讀取結(jié)果：片段越小越接近凝膠底部，由底部向上依次讀出新合成鏈的5＇→3＇方向的DNA堿基序列。
而改進后的Sanger測序利用熒光信號采集技術(shù)，自動化讀取結(jié)果：片段越小越先通過熒光信號采集器，由通過時間的先后和熒光信號自動記錄堿基序列。
初代測序技術(shù)特點及應用
Sanger測序法自面世以來經(jīng)過40年的不斷發(fā)展，讀長可達1000bp，測序準確度高達99%，是基因序列測定的金標準[2]。但此法的局限在于：只適合對已知突變位點進行檢測且只能測出部分變異形式，如檢測點突變、小片段插入/缺失；通量低，導致需要獲得大量信息的成本較高；靈敏度較低，對于腫瘤樣本突變率低于10~15%的變異，檢出難度較大[3]。
隨著精準時代的到來，Sanger測序法仍在qPCR檢測和高通量測序技術(shù)的結(jié)果驗證、鑒定、微生物種類鑒定和科研等各個方向發(fā)揮著重要作用。Sanger測序法為我們打開了合成測序的大門，同時為大規(guī)�；蚪M測序的誕生奠定了基礎(chǔ)。
蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司提供的基因測序儀、凝膠成像儀、電泳儀、電泳槽、PCR擴增儀等廣泛應用于初代測序。
初代測序技術(shù)分類
Maxam-Gilbert化學降解法測序
1. 測序原理：先對DNA片段的5＇或3＇端進行放射性標記，再采用特異性化學試劑修飾和裂解特定的堿基位點，從而得到一系列有共同放射起點但長度不一的DNA片段混合物，通過對此混合物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳即可從放射自顯影片直接讀出DNA堿基序列。
2. 堿基序列的識讀：聚丙烯酰胺凝膠電泳可以將DNA片段混合物按片段大小分開，片段越小越接近凝膠底部。因為化學降解反應并非絕對的堿基特異性反應，在識讀時需從A+G泳道中扣除G泳道的條帶而推斷A堿基，從C+T泳道中扣除C泳道的條帶而推斷T堿基，即若A+G泳道中出現(xiàn)一條帶且G泳道中有相同大小的帶，則識讀為G堿基，若G泳道中沒有相同大小的帶，則識讀為A堿基。[1]
圖1 化學降解法測序反應示意圖
在不同點切割相同的DNA標記片段會產(chǎn)生不同大小的標記片段，然后通過凝膠電泳分離片段
但由于化學降解法測序技術(shù)對待測DNA要求較高、操作繁瑣、試劑毒性大、放射性標記率偏低等原因，并未得到廣泛應用。
Sanger雙脫氧鏈終止法測序
1. 測序原理：以待測單鏈DNA為模板，在引物的引導下依據(jù)堿基互補配對的原則，隨機引入底物：4種dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)和4種ddNTP(ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP)。在DNA聚合酶的作用下，若引入dNTP則新生鏈繼續(xù)延伸，若引入ddNTP則新生鏈合成終止。因此反應結(jié)束后體系中得到一系列長度不一的DNA片段混合物，通過電泳對此混合物按分子量大小分開即可讀出DNA堿基序列。
圖2 傳統(tǒng)（a） VS 改進后（b）Sanger法測序原理示意圖傳統(tǒng)Sanger測序采用放射性核素標記引物，分成4管反應體系，通過平板聚丙烯凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行分離。而改進后的Sanger測序采用熒光素標記標記ddNTP或標記引物，熒光素標記ddNTP時可實現(xiàn)4管反應在同一管中進行，通過毛細管電泳對PCR產(chǎn)物進行分離。
2. 堿基序列的識讀：通過電泳將DNA片段混合物按片段大小分開，傳統(tǒng)Sanger測序利用放射自顯影技術(shù)，人工讀取結(jié)果：片段越小越接近凝膠底部，由底部向上依次讀出新合成鏈的5＇→3＇方向的DNA堿基序列。
而改進后的Sanger測序利用熒光信號采集技術(shù)，自動化讀取結(jié)果：片段越小越先通過熒光信號采集器，由通過時間的先后和熒光信號自動記錄堿基序列。
初代測序技術(shù)特點及應用
Sanger測序法自面世以來經(jīng)過40年的不斷發(fā)展，讀長可達1000bp，測序準確度高達99%，是基因序列測定的金標準[2]。但此法的局限在于：只適合對已知突變位點進行檢測且只能測出部分變異形式，如檢測點突變、小片段插入/缺失；通量低，導致需要獲得大量信息的成本較高；靈敏度較低，對于腫瘤樣本突變率低于10~15%的變異，檢出難度較大[3]。
隨著精準時代的到來，Sanger測序法仍在qPCR檢測和高通量測序技術(shù)的結(jié)果驗證、鑒定、微生物種類鑒定和科研等各個方向發(fā)揮著重要作用。Sanger測序法為我們打開了合成測序的大門，同時為大規(guī)�；蚪M測序的誕生奠定了基礎(chǔ)。
蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司提供的基因測序儀、凝膠成像儀、電泳儀、電泳槽、PCR擴增儀等廣泛應用于初代測序。
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