2.轉(zhuǎn)移性腫瘤富集免疫抑制細(xì)胞，尤其是MRC1+CCL18+M2-like巨噬細(xì)胞
考慮到患者的細(xì)胞組成不同，文章使用scDC來估計(jì)細(xì)胞比例，過濾了低豐度的免疫細(xì)胞，聚類免疫細(xì)胞比例(下圖A)。在未處理的樣本中，免疫細(xì)胞豐度可分為六種不同的模式(鄰近結(jié)直腸癌高、結(jié)直腸癌高、鄰近肝臟高、LM高、結(jié)直腸癌高和肝臟高)。鄰近的結(jié)直腸癌樣本顯示AIM2+記憶B細(xì)胞、TCLIA+-naive B細(xì)胞和CD4+-naive T細(xì)胞比例最高，而結(jié)直腸癌樣本大多富集FOXP3+ Tregs。MAIT細(xì)胞、NK細(xì)胞和FGFBP2+GZMB+ CD8+ T細(xì)胞在鄰近的正常肝組織中富集。相反，肝轉(zhuǎn)移中特異性存在一些免疫抑制細(xì)胞，其中SPPI+巨噬細(xì)胞和MRCI+ CCL18+巨噬細(xì)胞急劇增加(圖2B)。文章發(fā)現(xiàn)MRCI+CCL18+巨噬細(xì)胞具有Kupffer細(xì)胞特征，這表明它們可能來源于肝Kupffer細(xì)胞。中性粒細(xì)胞，據(jù)報(bào)道作為潛在的原體參與者，也在肝轉(zhuǎn)移中富集(下圖B)。我們進(jìn)一步使用單樣本基因集富集分析(ssGSEA)來量化免疫細(xì)胞亞群的空間分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MRCI+ CCL18+巨噬細(xì)胞和SPP1+巨噬細(xì)胞在未經(jīng)治療的肝轉(zhuǎn)移中富集(下圖C)。這些數(shù)據(jù)與scRNA-seq的數(shù)據(jù)部分一致，進(jìn)一步證實(shí)了肝轉(zhuǎn)移的潛在抑制性TME。

文章使用多重免疫組化(mIHC)對(duì)另外27例CRLM患者(n = 18，未經(jīng)治療;n = 9, NAC-PR)。在未經(jīng)處理的樣本中，觀察到FOXP3+ Tregs、MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞和SPP1+巨噬細(xì)胞在結(jié)直腸癌和肝轉(zhuǎn)移中的浸潤(rùn)顯著增加，這與scRNA-seq數(shù)據(jù)基本一致(圖F)。其次，文章利用ssGSEA對(duì)CRLM的批量微陣列數(shù)據(jù)集中的免疫細(xì)胞進(jìn)行評(píng)分。文章檢查了原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤之間的細(xì)胞豐度。在該驗(yàn)證隊(duì)列中，MRCI+ CCL18+巨噬細(xì)胞、SPP1+巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在轉(zhuǎn)移性腫瘤中均顯著升高。TCGA數(shù)據(jù)隊(duì)列中原發(fā)腫瘤中MRC1+CCL18+巨噬細(xì)胞和SPP1+巨噬細(xì)胞的高評(píng)分均預(yù)示預(yù)后明顯較差。推測(cè)特定的巨噬細(xì)胞亞群可能在CRLM中原生細(xì)胞生態(tài)位的形成中起著重要作用。

3. 轉(zhuǎn)移性腫瘤中巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)向抑制狀態(tài)
鑒于肝臟轉(zhuǎn)移中巨噬細(xì)胞亞群的富集，文章假設(shè)這些肝臟轉(zhuǎn)移富集的巨噬細(xì)胞在不同的組織中可能具有不同的功能。因此，我們進(jìn)行基于配體受體的癌癥免疫串?dāng)_分析，比較原發(fā)和轉(zhuǎn)移部位。結(jié)果顯示SPP1+巨噬細(xì)胞和MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞在肝轉(zhuǎn)移和結(jié)直腸癌的所有不同的交叉通話細(xì)胞類型中排名較高。這一結(jié)果表明，肝轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞可能會(huì)優(yōu)先重編程巨噬細(xì)胞并誘導(dǎo)其特定的功能狀態(tài)(下圖A)。值得注意的是，肝轉(zhuǎn)移中的轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)配體CD47。文章進(jìn)一步利用mIHC對(duì)這些蛋白進(jìn)行共表達(dá)可視化。這些配體受體對(duì)特異性富集于肝轉(zhuǎn)移，為靶向治療肝轉(zhuǎn)移提供了線索。

為了精確定位特異的TME印跡的差異，文章在結(jié)直腸癌和肝轉(zhuǎn)移巨噬細(xì)胞之間進(jìn)行了差異基因表達(dá)分析。APOE和其他M2極化相關(guān)基因如MARCO也在肝轉(zhuǎn)移富集的MRC1+CCL18+巨噬細(xì)胞中顯著上調(diào)(下圖E)。相比之下，富集于結(jié)直腸癌的MRC1+CCL18+巨噬細(xì)胞具有更高水平的炎性細(xì)胞因子表達(dá)，包括TNF、ILIB、CCL3和CCL4。通路富集分析顯示(下圖F)，在結(jié)直腸癌和肝轉(zhuǎn)移的MRC1+ CCL18巨噬細(xì)胞中，代謝通路都顯著富集，突出了代謝在決定這些巨噬細(xì)胞功能中的基本作用。值得注意的是，文章發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中MRC1+ CCL18t巨噬細(xì)胞富集氧化磷酸化，而肝轉(zhuǎn)移中MRC1+ CCL18t巨噬細(xì)胞以氨基酸代謝為主。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)，代謝調(diào)節(jié)可能介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的表型和功能轉(zhuǎn)移，以響應(yīng)不同的微環(huán)境改變。
 

4. 在肝轉(zhuǎn)移中MRC1+CCL18+巨噬細(xì)胞代謝活性急劇增加
為了了解髓系細(xì)胞在CRLM中的代謝圖景，文章通過scMetabolism計(jì)算抑制性巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞在每一條代謝通路中的活性得分。結(jié)果顯示肝轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)的MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞在所有髓系細(xì)胞中表現(xiàn)出最高的代謝活性，表明它們非常有活力，這可能與它們?cè)谵D(zhuǎn)移部位的獨(dú)特功能有關(guān)。進(jìn)一步對(duì)MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞的所有代謝相關(guān)基因進(jìn)行無監(jiān)督聚類，觀察到與周圍組織相關(guān)的強(qiáng)烈代謝偏好，在結(jié)直腸癌和肝轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)的MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞中鑒定出42種可能上調(diào)的代謝途徑。差異表達(dá)的代謝基因并發(fā)現(xiàn)原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性浸潤(rùn)的MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞中代謝基因特異性上調(diào)。ILAI1和MIF是巨噬細(xì)胞激活所必需的基因也表現(xiàn)出類似的特征。文章使用mIHC驗(yàn)證了這些代謝酶，觀察到基本一致的結(jié)果。結(jié)果表明代謝在決定MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞表型中起著重要作用。

5. NAC響應(yīng)與非響應(yīng)性腫瘤包含獨(dú)特的免疫動(dòng)態(tài)
為了探索NAC對(duì)抗腫瘤免疫的影響，文章使用TooManyCells對(duì)所有CD45+細(xì)胞進(jìn)行了聚類分析。結(jié)果表明結(jié)直腸癌和肝轉(zhuǎn)移的細(xì)胞聚類有明顯的差異（下圖A）。NAC對(duì)TME的影響具有高度的細(xì)胞類型特異性和環(huán)境依賴性（下圖B\C）。通常，在PR腫瘤中，NAC可以下調(diào)免疫抑制細(xì)胞并激活細(xì)胞毒性細(xì)胞。在肝轉(zhuǎn)移中，反應(yīng)性NAC下調(diào)了SPP1+巨噬細(xì)胞，上調(diào)了GZMK+ CD8+ T細(xì)胞和XCL1+ CD8+ T細(xì)胞等細(xì)胞毒性T細(xì)胞，特別是在NAC- pr腫瘤中保留了幾個(gè)MRC1t+CCL18+巨噬細(xì)胞和幾十個(gè)SPP1+巨噬細(xì)胞，提示NAC在抑制巨噬細(xì)胞譜系中的潛在作用。然而，在PD/SD腫瘤中，存在與PR腫瘤不同的免疫細(xì)胞變化。例如，肝轉(zhuǎn)移中SPP1t巨噬細(xì)胞和MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞水平升高，而細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞(即FGFBP2+GZMB+CD8+ T細(xì)胞)水平下調(diào)(下圖C、E和F)。這些相反的結(jié)果可能是由器官特異性和治療療效相關(guān)的癌細(xì)胞重塑所解釋的�？傊�，這些結(jié)果表明，有效的NAC不僅能重編程腫瘤內(nèi)免疫平衡，還能激活全身抗腫瘤免疫反應(yīng)，為支持NAC在可切除的CRLM中的潛在應(yīng)用提供了證據(jù)。
 

結(jié)論
本文使用scRNA-seq和ST.定義了CRLM的細(xì)胞和空間免疫景觀。數(shù)據(jù)顯示，在肝轉(zhuǎn)移中，免疫微環(huán)境經(jīng)歷了廣泛的時(shí)空重塑，免疫抑制細(xì)胞顯著富集，這與之前基于大量樣本的研究一致。特別是，MRC1+ CCL18+巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為終末分化狀態(tài)，表現(xiàn)為代謝活躍的表型，對(duì)新輔助化療敏感。該研究不僅揭示了以前未被認(rèn)識(shí)到的CRLM免疫生態(tài)系統(tǒng)的多樣性，而且為癌癥研究界提供了更為全面的資源。

參考文獻(xiàn)：
Wu Y, Yang S, Ma J, Chen Z, Song G, Rao D, Cheng Y, Huang S, Liu Y, Jiang S, Liu J, Huang X, Wang X, Qiu S, Xu J, Xi R, Bai F, Zhou J, Fan J, Zhang X, Gao Q. Spatiotemporal Immune Landscape of Colorectal Cancer Liver Metastasis at Single-Cell Level. Cancer Discov. 2022 Jan;12(1):134-153. doi: 10.1158/2159-8290.CD-21-0316. Epub 2021 Aug 20. PMID: 34417225.