本文要點：詳細描述微血管改變需要能夠提供形態(tài)和功能信息的高分辨率3D成像方法�，F(xiàn)有的光學顯微鏡工具通常用于微血管造影，但在可實現(xiàn)的視野和空間分辨率之間提供了次優(yōu)的權衡，生物組織中的強光散射進一步限制了可實現(xiàn)的穿透深度。本文介紹了一種基于立體視覺結合超分辨率定位成像的體積深部組織微血管造影新方法，該方法克服了寬場成像結構中光擴散和光學衍射對空間分辨率的限制。該方法利用了第二個近紅外窗口（NIR-Ⅱ，≈1000-1700 nm）中流動熒光顆粒的定位和跟蹤，并通過三角測量和立體匹配兩個在雙視圖模式下運行的短波紅外相機獲取的圖像來增加第三（深度）維度。所提出的方法啟用的3D成像功能有助于微血管網絡的詳細可視化和精確的血流定量。在組織模擬模型中進行的實驗表明，在渾濁介質中，高分辨率可保存至4毫米的深度。整個小鼠皮層和穿透血管的經顱微血管造影在毛細血管水平分辨率下進一步顯示。

 

 

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背景：微循環(huán)的形態(tài)和功能變化與許多病理的發(fā)生和發(fā)展有關。激光散斑對比成像（LSCI）根據(jù)紅細胞運動引起的斑點圖案波動提供了二維動態(tài)血流灌注圖。但LSCI覆蓋的深度范圍非常淺，散斑模型的模糊性進一步阻礙了血流速度的量化。多光子顯微鏡利用其非線性激發(fā)機制產生的光學切片能力，得益于共聚焦，3D成像可以通過沿深度的機械物鏡平移，可調焦鏡頭，遠程聚焦，或混響光學環(huán)實現(xiàn)，此外，線掃描可以探測流速，但僅限于小視場（FOV） 內的預選血管中，通常為＜1毫米。光學相干斷層掃描已用于更深深度（≈1-2 mm）的微血管造影成像，通過檢測連續(xù)B掃描之間的振幅去相關。光學顯微鏡方法所能達到的有限的深度和視場，促進了基于超聲（US）和光聲學（OA）的新的深部組織成像方法的發(fā)展。與軟生物組織中的光子相比，利用超聲波的微不足道的散射，這些方法實現(xiàn)了幾mm到cm深度的高分辨率成像。超聲定位顯微鏡進一步實現(xiàn)了驚人的分辨率增強（≈十倍）和并通過跟蹤靜脈注射的微泡同時測量平面內速度。能夠檢測1000-1700 nm波長范圍內的光子的高效短波紅外（SWIR）相機的出現(xiàn)為在第二個近紅外（NIR-II）窗口中捕獲彈道光子開辟了一條新途徑，該窗口具有減少的光散射和自發(fā)熒光。寬場，共聚焦和光片顯微鏡NIR-II成像顯著增強了成像深度，相對于在可見光或第一近紅外（NIR-I）光譜下操作的其他光學方法所能達到的深度。具有高量子效率的NIR-II造影劑的開發(fā)進一步促進了深層組織成像。在本文在NIR-II窗口中提出了一種新的基于立體視覺的體積深部組織成像方法，該方法能夠實現(xiàn)小鼠大腦的3D經顱超分辨率微血管造影。

 

研究內容：

1、系統(tǒng)設計和表征：擬議系統(tǒng)的示意圖表示如圖1a所示。外照射由855 nm激光二極管提供，而兩個相同的SWIR相機用于以立體視角±20°的雙視角模式收集發(fā)射的熒光信號。對于這種布置，位于不同深度的熒光目標被投射在兩個傳感器上的不同位置。這些投影中的每一對點都可以對分離的熒光發(fā)射器進行3D定位。具體來說，點之間的橫向偏移，即所謂的視差，編碼發(fā)射器在感興趣體積（VOI）中的軸向位置，根據(jù)立體視覺參數(shù)對其進行三角測量（圖1b）。利用流動熒光微滴的稀疏性，在相機采集的每張圖像中以亞像素分辨率定位其中心。接下來是搜索圖像校正后位于相似水平坐標的匹配點對。通過3D跟蹤算法建立的流動目標軌跡疊加，最終呈現(xiàn)出體積圖像（圖1b）。與其他基于定位的成像方法一樣，如光激活定位顯微鏡或隨機光學重建顯微鏡，所提方法的理論分辨率受到定位精度的限制。后者是通過在平面顯微載玻片上以40 Hz幀速率渲染靜態(tài)微液滴的雙視圖圖像堆棧來估計的，總采集時間為50 s。液滴局部位置的變化有助于估計最大可實現(xiàn)的分辨率（圖1c）。請注意，微滴的尺寸小于光學系統(tǒng)的衍射極限，即在當前設置下為≈27.7μm，也就是說，它可以有效地被認為是理想的點源。假設局部點的分布由高斯函數(shù)很好地近似，則相應的全半寬最大值 （FWHM） 在x、y和z方向上分別為1.3、1.5和3.4 μm（圖1d）。請注意，定位精度取決于信噪比（SNR），對于較大的微液滴，信噪比更高。通過獲取平面棋盤圖案的明場圖像堆棧，進一步驗證了整個FOV的系統(tǒng)性能，該圖像使用電動載物臺在3 mm深度范圍內沿z軸以5μm步長平移（圖1e）。黑白方塊之間的交叉點在每個深度上定位，在圖1f中繪制為具有顏色編碼深度的點云。圖1g所示的相鄰平面之間估計深度偏移的直方圖的平均值和標準偏差（SD）為4.8±1.4μm，與掃描步驟相匹配。為了提高深度靈敏度，需要擴大立體視覺角度，以增加樣品在深度方向上的給定偏移引起的雙視圖之間的差異但是，增加角度會導致由每個相機的景深定義的兩個體積之間的傾斜，從而導致雙視圖提供的體積之間的重疊減少。為了平衡深度靈敏度和有效成像體積，因此選擇了±20°立體視角。這些表征測量表明，我們的方法原則上可以達到比毛細血管尺寸更好的空間分辨率，毛細血管尺寸對應于可以通過血液中的粒子跟蹤成像的最小結構。

 

圖1

 

2、散射介質中的三維成像性能：我們的方法在散射介質中可視化結構的能力首次在組織模擬成像中得到評估。作為原理的初步證明，我們對浸入1.2%脂質內溶液（圖2a）的微管進行成像，并將其傾斜，使模型內部的深度沿y軸呈恒定梯度增加。選擇脂質內濃度來模擬生物組織中散射系數(shù)的降低。通過將微液滴（直徑<20μm）以恒定流速注入管道進行體積成像。以18 Hz幀速率記錄了總持續(xù)時間為1分鐘的雙視圖圖像堆棧。通過疊加所有記錄的幀并用青色和紅色疊加在一起來獲得每個相機的寬場等效圖像（圖2b）。沿著深度梯度，寬場等效圖像的信噪比和分辨率迅速惡化，而雙視圖之間的位移表現(xiàn)出預期的線性增加。通過立體視覺定位單個流動微液滴的3D位置，重建了微管的體積視圖（圖2c）。圖2d顯示了相機1的2D寬場等效圖像與使用定位方法重建的側視圖之間的比較，說明后者明顯提高了散射介質中可實現(xiàn)的空間分辨率。正如預期的那樣，還觀察到計算的深度與沿y軸的橫向位移之間的近似線性關系（圖2e）。此外，在脂質內模型（圖2f）中，不同深度重建的微管的線條輪廓在4 mm深度幾乎不受影響，證實了所提出的系統(tǒng)的深層組織成像能力。我們用復雜的血管形狀樣品進一步評估了我們方法的3D性能。具體來說，將形成結圖案的管道浸入1.2%脂質內溶液中的≈2毫米深度。在注射微液滴后，使用與直微管相同的參數(shù)進行雙視圖記錄。通過疊加所有采集的幀來呈現(xiàn)來自每個相機的寬場等效圖像如圖2g所示，用青色和紅色編碼。在重建的圖像中清楚地解析了結的3D形狀（圖2h）。此外，微管重疊段的239.4μm深度差，與其外徑非常匹配，可以從側視圖區(qū)分開來（圖2i）。

 

圖2

 

3、大腦微循環(huán)的體內經顱圖譜：接下來，我們展示了所提出的方法在體內小鼠皮質脈管系統(tǒng)經顱成像的能力。通過3D追蹤流動的微液滴獲得深度分辨微循環(huán)圖（圖3a）。請注意，從圖像中心到邊緣觀察到的深度梯度是由于小鼠大腦的曲率（圖3a）�？梢娚疃冗_600μm的穿透小動脈和小靜脈，如所選VOI的放大視圖所示，大約Bregma -1.5 mm（圖3b）。來自三個視圖的相同VOI的血流速圖也通過微滴跟蹤呈現(xiàn)（圖3c）。圖3d顯示了通過選定VOI穿透血管跟蹤的單個微液滴的代表性延時雙視圖圖像。首先，兩個圖像中液滴的兩個投影之間的間隔距離減小，然后略有增加，這與局部3D位置觀察到的深度變化一致（圖3e）。作為交叉驗證，通過考慮局部光斑尺寸對深度相關光擴散的依賴性，也使用單相機估計了同一微液滴的深度。雖然我們的雙相機系統(tǒng)（基于立體視覺）和單相機系統(tǒng)（基于擴散）的深度估計總體上非常一致（圖3f），但使用單相機系統(tǒng)在測量的深度中觀察到更大的波動，這可能是由于生物組織的未知和異質散射特性。我們的技術實現(xiàn)的深度分辨能力進一步提供了基于3D跟蹤的總微滴速度的更準確的估計，特別是在穿透血管中（圖3g）。
 

圖3

 

總結：體積定位顯微血管造影提供的優(yōu)勢可以極大地促進微血管形態(tài)和循環(huán)的表征。本文所提出的技術能夠在以前光學方法無法達到的分辨率深度范圍內表征體內微血管結構。其相對簡單的實施非常適合在生物醫(yī)學研究界廣泛傳播。評估皮質微血管的已證明性能與研究中風和神經退行性疾病的根本原因和影響特別相關。此外，該方法可用于提高我們對微循環(huán)變化在癌癥，糖尿病，心血管疾病和其他病理狀況中的作用的認識。

 

 

參考文獻

Zhou, Q.; Nozdriukhin, D.; Chen, Z.; Glandorf, L.; Hofmann, U. A. T.; Reiss, M.; Tang, L.; Dean-Ben, X. L.; Razansky, D., Depth-Resolved Localization Microangiography in the NIR-II Window. Adv Sci (Weinh) 2022, 10 (1), e2204782.

 

 

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