百趣代謝組學(xué)文獻分享，細胞自噬不知大家是否了解？2016年，日本科學(xué)家大隅良典(Yoshinori Ohsumi)憑借“細胞自噬機制方面的發(fā)現(xiàn)”獲得了諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎！

自噬，通俗來說就是自己吃自己。代謝組學(xué)文獻分享，細胞自噬是指從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細胞內(nèi)需降解的細胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新。代謝組學(xué)文獻分享，細胞自噬對于回收細胞成分是必不可少的，在饑餓應(yīng)答時尤其重要。
 

今天小趣通過Nature Plants上的Maize multi-omics reveal roles for autophagic recycling in proteome remodelling and lipid turnover一文給大家詳細解讀如何運用多組學(xué)聯(lián)合分析闡述玉米自噬的影響。

一、代謝組學(xué)文獻分享—研究方法
玉米生長對氮缺乏高度敏感，這是其主要的農(nóng)業(yè)限制之一，因此本文作者利用氮脅迫研究玉米自噬的功效。代謝組學(xué)文獻分享，在植物中，主要的自噬途徑由一系列自噬相關(guān)（AUTOPHAGY-RELATED，ATG）蛋白質(zhì)介導(dǎo)，作者將野生型玉米（WT）和敲除核心自噬組分ATG12的突變體（atg12-1：完全敲除，atg12-2：中度敲除）在富氮(+N：15 mM)條件下培養(yǎng)2周，之后一部分繼續(xù)培養(yǎng)，剩余的轉(zhuǎn)至氮缺乏(-N：0.1mM)條件下培養(yǎng)，一周后取第二片和第四片葉進行各組學(xué)檢測，代謝組和離子組分別設(shè)置5個重復(fù)，轉(zhuǎn)錄組和蛋白組分別設(shè)置3個，每個重復(fù)由5片相似的葉片混合而成。
 

二、代謝組學(xué)文獻分享—研究結(jié)果
1.玉米atg12突變體對氮脅迫敏感
氮饑餓的玉米表現(xiàn)出強烈的生長抑制，但野生型尚未顯示加速葉片衰老，而atg12突變體明顯衰老。
 

圖1.野生型及atg12突變體在+N/-N中的生長狀態(tài)

氮脅迫改變了WT葉片的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組，氮代謝增加，葉綠素表達降低。代謝組學(xué)文獻分享，atg12突變體在低氮條件下過早衰老，氮缺乏影響葉片的發(fā)育（葉長、葉綠素）。ATG8蛋白家族及總蛋白的豐度在atg12突變體中升高，表明自噬對于維持植物中正常的蛋白質(zhì)豐度很重要，atg12突變體阻斷ATG8自噬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)換。

除了離子組，不同生長條件的玉米代謝組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組都能很好的分開，表明氮饑餓和自噬都影響玉米代謝組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組。
 

圖3.atg12突變體在富氮和饑餓條件下顯著改變玉米代謝組

在atg12突變體中，許多完整磷脂、鞘脂和半乳糖脂減少，脂質(zhì)分解產(chǎn)物累積增加，因此atg12可能與加速膜轉(zhuǎn)換和脂解作用有關(guān)；次級代謝的相關(guān)化合物，如具有強抗氧化活性的丁香酸、蘆丁和開環(huán)異落葉松樹脂酚強烈增加，而苯環(huán)合成途徑的中間體香草醛含量降低；抗氧化劑谷胱甘肽及其相關(guān)代謝物水平增加。代謝組學(xué)文獻分享，這意味著突變植物試圖通過合成廣泛的抗氧化劑來抵消代謝挑戰(zhàn)。
 

圖4.a.基于代謝功能/途徑的417個代謝物網(wǎng)絡(luò)圖。b.受atg12突變影響的脂質(zhì)及分解中間體和次級代謝相關(guān)化合物的箱式圖。

3.轉(zhuǎn)錄組
自噬嚴(yán)重影響玉米轉(zhuǎn)錄組，第二和第四片葉中分別有3,082、2,426個差異轉(zhuǎn)錄本（P≤0.05且FDR≤0.05）。代謝組學(xué)文獻分享，567個核心轉(zhuǎn)錄本（至少在四個條件中的三個存在一致差異）中，與晝夜節(jié)律、非生物脅迫、葉綠體和水楊酸反應(yīng)相關(guān)的在WT中顯著富集，而蛋白酶活性和對鋅的反應(yīng)顯著減少。在atg12葉中編碼蛋白酶的mRNA的增加反映了在缺乏自噬的情況下可能激活了恢復(fù)氨基酸再循環(huán)的替代蛋白水解途徑。脂質(zhì)代謝沒有作為重要的GO功能出現(xiàn)，但是編碼許多脂肪酶的轉(zhuǎn)錄物顯著上調(diào)。
 

圖5.突變體在富氮和饑餓條件下顯著改變玉米轉(zhuǎn)錄組。a.atg12-1和atg12-2突變同樣影響玉米轉(zhuǎn)錄組。b.熱圖顯示在+ N或-N中生長的WT與atg12突變體的差異轉(zhuǎn)錄本。c.維恩圖顯示atg12突變體與WT中差異一致的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量。d.核心轉(zhuǎn)錄本的對應(yīng)GO功能的富集/消耗。e.特定GO功能的代表性轉(zhuǎn)錄物受到atg12突變+/- N的影響。

4.離子組
常見元素定量分析結(jié)果顯示atg12-1和atg12-2與野生型相比未能檢測到強烈且一致的變化。鋁、鈉、銅、鎂和硒，在氮缺乏的atg12植物的第二片葉子中略微超積累，這可能反映了自噬具有一定動員這些元素的作用。代謝組學(xué)文獻分享，有趣的是磷，在atg12突變體中似乎加速了膜轉(zhuǎn)換，然而，磷只在氮缺乏的atg12-1葉中顯著增加。
 

圖6.atg12突變體第2和第4片葉元素離子含量的細微差別。

5.蛋白組
自噬嚴(yán)重影響玉米蛋白質(zhì)組，第二和第四片葉中分別有673、666個差異蛋白（P≤0.05且FDR≤0.05）。在atg12突變體中蛋白積累更多，在atg12-1中差異更大，與總蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析一致。代謝組學(xué)文獻分享，許多“細胞組分”和“生物過程”相關(guān)蛋白在atg12中顯著過表達，包括與過氧化物酶體、ER和胞質(zhì)溶液相關(guān)的蛋白質(zhì)組，和/或涉及小分子，羧酸鹽、脂肪酸、苯丙烷和葡萄糖代謝的蛋白質(zhì)，其中一些被預(yù)測為自噬靶標(biāo)和/或之前已經(jīng)證明在atg12突變下含量升高，類囊體和光合作用相關(guān)蛋白在突變體中降低，這可能與葉片早衰有關(guān)。
 

圖7.突變體在富氮和饑餓條件下顯著改變玉米蛋白組。a.atg12-1和atg12-2突變體同樣影響玉米蛋白質(zhì)組。b.熱圖顯示在+ N或-N中生長的WT與atg12突變體的差異蛋白。c.火山圖顯示atg12-1與WT葉中單個蛋白質(zhì)的優(yōu)先積累。d、e.圖c中差異蛋白的特定GO功能的富集/消耗，d.“細胞成分”的富集。e.“生物過程”的富集。Cat.：分解代謝。

過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、蛋白酶體、苯丙烷代謝與脂肪酸代謝相關(guān)蛋白在atg12突變體中升高，類囊體在atg12-1突變體中降低，而氮饑餓能夠促進這些積累，因此這些區(qū)室/過程可能是自噬底物。
 

圖8.atg12突變對玉米葉片中細胞區(qū)室、代謝過程和蛋白質(zhì)復(fù)合物的影響。a、c.火山圖顯示atg12-1與WT葉中特定區(qū)室、代謝過程或蛋白質(zhì)復(fù)合物的相關(guān)蛋白質(zhì)的優(yōu)先積累。b、d.特定GO功能中的代表性蛋白質(zhì)豐度變化。

6.蛋白、轉(zhuǎn)錄與代謝關(guān)聯(lián)分析
atg12-1突變體中差異蛋白大部分僅豐度發(fā)生顯著變化，相應(yīng)的mRNA未變化，表明突變體中大多數(shù)蛋白質(zhì)的增加受自噬影響，而與合成無關(guān)（即轉(zhuǎn)錄和/或翻譯）。代謝組學(xué)文獻分享，苯丙烷類和氨基酸代謝相關(guān)蛋白和mRNA都升高，表明這些蛋白質(zhì)水平的升高至少部分地由合成升高引起，這與這些途徑相關(guān)的代謝物水平的變化相一致。內(nèi)膜、過氧化物酶體、高爾基體、胞質(zhì)溶膠、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、蛋白酶體和與脂肪酸和蛋白質(zhì)分解代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)水平升高，但是相應(yīng)的mRNA未增加，這可能是自噬清除的抑制引起，而不是由增加合成引起的。代謝組學(xué)文獻分享，突變體中類囊體的消耗再次與atg12植物中葉綠體的加速分解一致，這可能是沒有自噬的情況下其他分解代謝途徑的驅(qū)使。

atg12突變體誘導(dǎo)的脂質(zhì)代謝相關(guān)的主要mRNA和蛋白質(zhì)水平的代謝物的改變一致。atg12葉片中脂肪酸水平積累，這與通過β-氧化參與脂肪酸分解的過氧化物酶體變化趨勢相同，認(rèn)為過度累積的過氧化物酶體是功能障礙的隔室，等待自噬清除，因此不能勝任代謝脂肪酸的功能，暗示突變體中脂肪酸和脂質(zhì)分解產(chǎn)物的過度積累是由自噬調(diào)節(jié)的其他分解代謝過程缺陷引起的；atg12脂肪酸的積累與脂肪酸β-氧化途徑中相關(guān)蛋白增加（相應(yīng)mRNA未增加）的現(xiàn)象相脫節(jié)，這或者與蛋白清除相關(guān)。代謝組學(xué)文獻分享，與之相反，苯丙烷代謝、類黃酮代謝和花青素代謝途徑中間產(chǎn)物水平與蛋白酶及相應(yīng)mRNA一致。
 

圖9.轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組比較鑒定了受轉(zhuǎn)錄和/或自噬影響的過程。a.散點圖顯示了atg12-1與WT的蛋白質(zhì)和mRNA豐度變化之間的關(guān)系。b.圖a中有色區(qū)域?qū)��?yīng)的主要GO功能。c.散點圖顯示atg12-1與WT植物中特定GO功能對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)的相對豐度間的相關(guān)性。d、e、f、g.簡化的代謝流程圖描述了在高氮條件下第二片葉子中atg12-1與WT的代謝物、相關(guān)蛋白及其相應(yīng)mRNA的變化。e.脂質(zhì)代謝主要途徑的流程圖。f.脂肪酸分解代謝的β-氧化途徑流程圖。g.苯丙烷、木脂素、類黃酮和花青素合成路線的組合流程圖。沒有顏色/沒有值的隔室表示未檢測到的代謝物/ mRNA /蛋白質(zhì)。

7.RT-PCR
參與脂質(zhì)代謝的蛋白質(zhì)、顆粒蛋白半胱氨酸蛋白酶和絲氨酸羧肽酶、過氧化物酶體PEX14、線粒體VDAC蛋白編碼的許多mRNA的RT-qPCR結(jié)果證實了atg12突變對轉(zhuǎn)錄物豐度的影響。代謝組學(xué)文獻分享，免疫印跡分析證實PEX14、VDAC和ER定位的ACA2在atg12-1背景中更豐富，因此可能是自噬靶標(biāo)，類似已知的自噬調(diào)控者或靶標(biāo)：ATG8、NBR1自噬受體和蛋白酶體亞基PBA1和RPT4。有趣的是，所有這些蛋白質(zhì)在低氮條件下生長的葉片中含量較少，這意味著它們在氮饑餓時會加速其自噬轉(zhuǎn)換。
 

圖10.定量RT-PCR和免疫印跡分析證實了幾種轉(zhuǎn)錄物豐度的明顯變化和atg12突變體中細胞器特異性蛋白質(zhì)的積累。a.特定轉(zhuǎn)錄物的表達變化。b.特定蛋白的豐度變化。

三、代謝組學(xué)文獻分享—總結(jié)與討論
1.富氮和氮缺乏條件下，自噬都改變了玉米轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組，并且強烈地改變了葉片代謝，特別是在脂質(zhì)分解以及次級產(chǎn)物的積累方面。atg12突變體僅在氮饑餓時引起視覺癥狀。

2.玉米第二片葉可能反映出更強大的自噬系統(tǒng)，這些系統(tǒng)準(zhǔn)備重新調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)以支持新的生長，并在其衰老時有效地分解代謝。

3.證實了自噬清除過氧化物酶體、線粒體、核糖體和蛋白酶體，并指出了降解ER和高爾基體的可能作用。

4.該研究為多組學(xué)在植物中的運用提供了參考，同時也為研究植物的自噬過程提供依據(jù)。