蛋白的重組表達(dá)是指將外源基因克隆在含有特定啟動(dòng)子的表達(dá)載體中，讓其在大腸桿菌中在IPTG的誘導(dǎo)下過(guò)量表達(dá)。

蛋白質(zhì)純化的第一步是在細(xì)胞宿主中表達(dá)蛋白質(zhì)。制備的pET28-His6-GFP含有iptg誘導(dǎo)的His6-GFP。一旦細(xì)胞開(kāi)始生長(zhǎng)，將通過(guò)添加IPTG“誘導(dǎo)”它們制造蛋白質(zhì)。然后將讓它們繼續(xù)生長(zhǎng)并生產(chǎn)蛋白質(zhì)幾個(gè)小時(shí)，然后通過(guò)離心收集細(xì)胞。

材料

1mL過(guò)夜培養(yǎng)的由pET28-His6-GFP轉(zhuǎn)化的BL21細(xì)胞

1000X 卡那霉素原液

100M IPTG儲(chǔ)備液

50mL液體LB培養(yǎng)基

步驟

1. 在50mL LB中加入1000X卡那霉素，使最終濃度為1X。攪拌均勻。

2. 將過(guò)夜培養(yǎng)液1:100稀釋到50mL LB中，并加入1X卡那霉素。在37°C搖晃培養(yǎng)。定期取1mL樣品檢查OD600(測(cè)量細(xì)菌濃度)。

3. 當(dāng)OD600達(dá)到0.6-1.0(大約2小時(shí))時(shí)，將IPTG加入，最終濃度為500µM。這將誘導(dǎo)His6-GFP蛋白的表達(dá)。

4. 將培養(yǎng)液在37°C搖晃16-24小時(shí)，使其生長(zhǎng)并表達(dá)GFP。請(qǐng)注意，在某些情況下，誘導(dǎo)后降低溫度可能有助于蛋白質(zhì)折疊。

5. 16-24小時(shí)后，將培養(yǎng)液倒入50mL錐形管中。

6. 將顆粒細(xì)胞在離心機(jī)中以4000g旋轉(zhuǎn)10分鐘。記得要平衡離心機(jī)!

7. 將上清液倒入廢液容器中(靠近水槽)。我們將漂白介質(zhì)，以確保介質(zhì)中殘留的細(xì)菌在排入下水道之前被殺死。

8. 冷凍細(xì)胞顆粒，直到準(zhǔn)備好開(kāi)始蛋白質(zhì)純化。