自噬是一種進化上保守的機制，有助于真核細胞維持平衡和更新。它參與調(diào)控了多個重要的細胞過程，包括維持細胞干性、促進胚胎發(fā)育、形成固有免疫，并影響衰老和長壽。傳統(tǒng)的觀點認為，自噬是蛋白質(zhì)水平上的一系列細胞質(zhì)事件，但近年來的證據(jù)表明，細胞核轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳調(diào)控也對這一過程有深遠的影響。

在細胞適應因營養(yǎng)缺乏及其他代謝紊亂引起的代謝變化時，自噬也發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。一些營養(yǎng)傳感器被證明可以調(diào)節(jié)自噬，從而維持細胞代謝和能量穩(wěn)態(tài)。然而，m⁶A等表觀轉(zhuǎn)錄組修飾在饑餓誘導自噬的調(diào)節(jié)中發(fā)揮什么作用，目前還不清楚。

近日，南方醫(yī)科大學等機構(gòu)的研究人員在《Nature Communications》雜志上發(fā)表論文，首次揭示了m⁶A閱讀器YTHDF3作為營養(yǎng)反應器調(diào)節(jié)自噬誘導的作用和機制，為RNA轉(zhuǎn)錄后修飾應對營養(yǎng)缺乏應激的范式提供了新見解。
 

圖片來源：Nature Communications

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員使用了小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）。利用賽業(yè)生物提供的YTHDF3^+/−小鼠，他們構(gòu)建了YTHDF3^−/−小鼠胚胎。在整個實驗過程中，他們使用了基于LC-MS的蛋白質(zhì)組分析、RNA免疫共沉淀測序分析（RIP-seq）和MeRIP-seq分析、免疫熒光染色和自噬流分析等。他們還通過LC-MS/MS和m⁶A斑點印跡測定了m⁶A修飾水平。

技術(shù)路線
01 通過蛋白質(zhì)組學分析發(fā)現(xiàn)饑餓狀態(tài)下的YTHDF3蛋白水平升高
02 通過RNA干擾實驗證實YTHDF3上調(diào)是自噬所必需的
03 在分析m⁶A水平后發(fā)現(xiàn)饑餓處理提高了m⁶A修飾水平，而YTHDF3需要METTL3介導的m⁶A修飾來促進自噬
04 通過RIP-seq和MeRIP-seq等分析發(fā)現(xiàn)FOXO3是YTHDF3促進自噬的關(guān)鍵功能靶點
05 YTHDF3與FOXO3 mRNA終止密碼子附近的m⁶A修飾位點結(jié)合，然后招募eIF3a和eIF4B來促進FOXO3翻譯

研究結(jié)果
1.YTHDF3上調(diào)是自噬誘導所必需的
為了鑒定與自噬相關(guān)的表觀轉(zhuǎn)錄組分子，研究人員對營養(yǎng)缺乏狀態(tài)下的小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）開展了蛋白質(zhì)組學分析。有趣的是，他們發(fā)現(xiàn)m⁶A閱讀器YTHDF3的水平顯著升高。

為了分析YTHDF3誘導是否與自噬發(fā)生有關(guān)，他們利用shRNA載體來敲低MEF中的YTHDF3的表達，發(fā)現(xiàn)自噬標志物LC3-II水平下降，而自噬受體蛋白p62積累，表明自噬流降低。挽救實驗表明，YTHDF3的異位表達能夠提高LC3-II水平，并加快p62降解。他們還利用賽業(yè)生物提供的YTHDF3^+/−小鼠繁育YTHDF3^−/−小鼠胚胎并獲得了YTHDF3^−/− MEF細胞，發(fā)現(xiàn)YTHDF3缺失導致MEF細胞中自噬體和自噬性溶酶體數(shù)量大幅減少。這些數(shù)據(jù)表明，YTHDF3上調(diào)是營養(yǎng)缺乏期間的自噬誘導所必需的。此外，后續(xù)的分析表明，YTHDF3缺失損害了自噬體形成和溶酶體功能。

2.YTHDF3需要m⁶A修飾來促進自噬
考慮到Y(jié)THDF3是m⁶A閱讀器，研究人員接著探索了YTHDF3是否需要m⁶A修飾來促進自噬。他們發(fā)現(xiàn)，m⁶A修飾在營養(yǎng)缺乏時顯著增加，表明mRNA的m⁶A水平在自噬誘導期間升高。在分析m⁶A修飾的書寫器（負責添加修飾）和擦除器（負責去除修飾）后，他們發(fā)現(xiàn)只有書寫器METTL3在營養(yǎng)缺乏后顯著升高（圖1）。
 

圖1 YTHDF3需要METTL3介導的m⁶A修飾來促進自噬^[1]
 

圖2 YTHDF3識別饑餓誘導的FOXO3 mRNA的m⁶A高甲基化^[1]

之后，通過進一步的分析，研究人員發(fā)現(xiàn)YTHDF3的作用可能是調(diào)節(jié)FOXO3的翻譯，而不是FOXO3的翻譯后修飾（如磷酸化）。他們發(fā)現(xiàn)，YTHDF3以METTL3依賴性的方式調(diào)節(jié)FOXO3的表達，并改變FOXO3靶向的自噬基因的表達。他們還在YTHDF3缺陷型細胞中異位表達了FOXO3，發(fā)現(xiàn)LC3-II的表達得到恢復，p62逐漸降解。這些結(jié)果表明，FOXO3是YTHDF3促進自噬的關(guān)鍵功能靶點。

4.YTHDF3促進FOXO3的翻譯，但不影響其mRNA的穩(wěn)定性
研究人員發(fā)現(xiàn)，敲低YTHDF3并不影響FOXO3 mRNA的水平，表明YTHDF3可能對FOXO3的翻譯有影響。YTHDF3已被報道通過與40S和60S核糖體亞基相互作用促進RNA的翻譯，于是他們開展了多聚核糖體分析，發(fā)現(xiàn)在YTHDF3缺陷型細胞中，F(xiàn)OXO3 mRNA在多聚核糖體中的水平低于對照細胞，表明YTHDF3缺失減弱了FOXO3翻譯。通過突變分析，他們進一步確認了FOXO3-CDS終止密碼子附近的m⁶A位點在YTHDF3促進FOXO3翻譯時發(fā)揮關(guān)鍵作用。同樣地，F(xiàn)OXO3-3’ UTR區(qū)域終止密碼子附近的m⁶A位點也參與了FOXO3翻譯調(diào)節(jié)。

翻譯控制通常發(fā)生在起始階段。在開展co-IP LC-MS/MS分析后，研究人員注意到多個翻譯起始因子與YTHDF3存在相互作用。其中，eIF3a和eIF4B是營養(yǎng)缺乏時最明顯富集的。通過不同核糖體組分的Western blot分析和分子對接模型分析，他們認為eIF3a、eIF4B和YTHDF3之間很可能存在蛋白質(zhì)相互作用。在敲低eIF3a或eIF4B后，F(xiàn)OXO3蛋白水平降低，表明YTHDF3可能與eIF3a和eIF4B相互作用來促進FOXO3翻譯。

研究結(jié)論

圖3 YTHDF3誘導自噬的可能機制^[1]

總的來說，這項研究揭示了表觀轉(zhuǎn)錄組學與自噬之間的重要關(guān)聯(lián)。一系列的證據(jù)表明，m⁶A閱讀器YTHDF3作為營養(yǎng)反應器，與FOXO3 mRNA終止密碼子附近的m⁶A修飾位點結(jié)合，然后招募eIF來迅速促進FOXO3翻譯，并進一步從轉(zhuǎn)錄上激活一系列核心自噬基因，從而促進自噬（圖3）。

原文檢索：
[1] Hao, W., Dian, M., Zhou, Y. et al. Autophagy induction promoted by m⁶A reader YTHDF3 through translation upregulation of FOXO3 mRNA. Nat Commun 13, 5845 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32963-0

賽業(yè)小鼠模型構(gòu)建
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YTHDF3 KO小鼠

品系名稱：
C57BL/6N-Ythdf3^em1Cya
品系編號：
KOCMP-229096-Ythdf3-B6N-VA
產(chǎn)品編號：
S-KO-06231
應用方向：
信號轉(zhuǎn)導,RNA剪接,蛋白質(zhì)代謝,RNA結(jié)合蛋白,代謝研究,生理系統(tǒng)
打靶方案：

YTHDF3 Flox小鼠

品系名稱：
C57BL/6N-Ythdf3^em1(flox)Cya
品系編號：
CKOCMP-229096-Ythdf3-B6N-VA
產(chǎn)品編號：
S-CKO-07230
應用方向：
代謝研究,蛋白質(zhì)代謝,信號轉(zhuǎn)導,RNA剪接,RNA結(jié)合蛋白
打靶方案：