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將自動(dòng)化和基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)融入非傳統(tǒng)微生物的設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試-學(xué)習(xí)循環(huán)研究
跟蹤智慧實(shí)驗(yàn)室的理論研究發(fā)展?fàn)顩r、產(chǎn)業(yè)發(fā)展動(dòng)態(tài)、主要設(shè)備供應(yīng)商產(chǎn)品研發(fā)動(dòng)態(tài)、國(guó)內(nèi)外智慧實(shí)驗(yàn)室建設(shè)成果現(xiàn)狀等信息內(nèi)容。本文由中科院上海生命科學(xué)信息中心與曼森生物合作供稿。
本期推文編譯了 Gurdo N 等發(fā)表在 Trends in Biotechnology 期刊上的綜述《將自動(dòng)化和基本發(fā)現(xiàn)融入非傳統(tǒng)微生物的設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試-學(xué)習(xí)循環(huán)》（Merging automation and fundamental discovery into the design-build-test-learn cycle of nontraditional microbes），該文作者提出了一種“以代謝為中心”的合成生物學(xué)設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試-學(xué)習(xí)循環(huán)的方法，并得到多組學(xué)分析的支持。
目錄/CONTENT
01/要點(diǎn)
02/用于生物生產(chǎn)的傳統(tǒng)和新興微生物平臺(tái)的調(diào)查
03/生物鑄造廠利用模型微生物宿主推進(jìn)生物生產(chǎn)
04/生物鑄造廠的細(xì)胞工廠設(shè)計(jì)和測(cè)試自動(dòng)化
05/通過(guò)自動(dòng)化和擴(kuò)展合成生物學(xué)工具箱，為基于非傳統(tǒng)宿主的細(xì)胞工廠鋪平道路
06/引入以代謝為中心的分析作為發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，指導(dǎo) DBTL 循環(huán)中的工程工作
07/觀點(diǎn)總結(jié)和未來(lái)方向
08/未解決的問(wèn)題
生物基工業(yè)的重大進(jìn)展使多種化學(xué)品的生物生產(chǎn)具有成本效益，但成功的工業(yè)過(guò)程相對(duì)稀缺，并且僅限于使用少數(shù)主力微生物作為宿主。深入了解非傳統(tǒng)微生物的生理學(xué)和代謝是釋放其生物技術(shù)潛力的關(guān)鍵。生物鑄造廠的誕生使構(gòu)建和測(cè)試大量為生物生產(chǎn)量身定制的微生物菌株的能力成倍增加——作者認(rèn)為其中的自動(dòng)化工作流程可以適應(yīng)獲得非傳統(tǒng)宿主的基本知識(shí)。在這里，作者提出了一種“以代謝為中心”的合成生物學(xué)設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試-學(xué)習(xí)循環(huán)的方法，并得到多組學(xué)分析的支持。
01
要點(diǎn)
由于合成生物學(xué)工具集和基礎(chǔ)知識(shí)有限，用于生物生產(chǎn)的非傳統(tǒng)宿主仍未得到充分開(kāi)發(fā)。多組學(xué)方法能夠?qū)ξ⑸锎x進(jìn)行系統(tǒng)級(jí)理解——將工程工作作為設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試-學(xué)習(xí) (DBTL：design–build–test–learn) 循環(huán)的基本要素來(lái)指導(dǎo)。生物鑄造廠能夠在創(chuàng)紀(jì)錄的時(shí)間內(nèi)生成和測(cè)試數(shù)百種微生物菌株——但對(duì)常見(jiàn)和非傳統(tǒng)宿主代謝特征的探索并未完全納入管道。自動(dòng)化在合成生物學(xué)和代謝工程中發(fā)揮著核心作用，除了減少工作流程時(shí)間外，還可以用作指導(dǎo)工程工作的發(fā)現(xiàn)工具。DBTL 循環(huán)中以代謝為中心的觀點(diǎn)有望加速細(xì)胞工廠組裝工作流程，同時(shí)提供有關(guān)基本生物學(xué)問(wèn)題的關(guān)鍵信息。
02
用于生物生產(chǎn)的傳統(tǒng)和新興微生物平臺(tái)的調(diào)查
可持續(xù)化學(xué)生產(chǎn)在不斷發(fā)展的生物基行業(yè)中占據(jù)了穩(wěn)固的地位，以替代目前幾乎完全來(lái)自化石資源的產(chǎn)品。生物底盤(pán)是使用代謝工程工具定制的，該工具產(chǎn)生多功能生物生產(chǎn)平臺(tái)（即細(xì)胞工廠），用于合成廣泛的大宗和精細(xì)化學(xué)品——支持更可持續(xù)、更綠色的社會(huì)。盡管對(duì)高價(jià)值（生物）產(chǎn)品的需求不斷增長(zhǎng)，繼續(xù)以前所未有的速度加速細(xì)胞工廠的發(fā)展，但為生物生產(chǎn)創(chuàng)建強(qiáng)大的微生物平臺(tái)是一項(xiàng)相對(duì)手工且耗時(shí)的工作。此外，難以合成的化合物——無(wú)論是由于其毒性還是因?yàn)樗鼈兪切碌淖匀晃镔|(zhì)，沒(méi)有可用于合成的天然生物催化劑，仍在等待大規(guī)模生產(chǎn)。實(shí)現(xiàn)這一目的的工程細(xì)胞工廠需要一個(gè)多步驟的設(shè)計(jì)和執(zhí)行策略，從生化網(wǎng)絡(luò)的計(jì)算機(jī)模擬到與規(guī)模相關(guān)的生物反應(yīng)器中所需代謝物的實(shí)際生物生產(chǎn)。整個(gè)過(guò)程所需的時(shí)間跨度取決于幾個(gè)方面；首先，用于選定宿主基因組工程的遺傳元件（即部分）的可用性和可及性；其次，評(píng)估包含實(shí)驗(yàn)室規(guī)模生物生產(chǎn)所需修改的初始原型；最后，優(yōu)化不同的參數(shù)以增加滴度并最大化目標(biāo)化合物的通量以及生物工藝放大。在滿足與工業(yè)規(guī)模生物生產(chǎn)兼容的關(guān)鍵性能參數(shù) 之前，此序列的迭代對(duì)于提高工程底盤(pán)的性能是必要的。
革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌和酵母釀酒酵母是常規(guī)用于構(gòu)建細(xì)胞工廠的常規(guī)底盤(pán)。對(duì)其生理學(xué)和遺傳學(xué)的深入了解，以及廣泛的遺傳工具的可用性，使這些微生物在爭(zhēng)取最佳生物生產(chǎn)平臺(tái)的競(jìng)賽中處于領(lǐng)先地位。許多例子展示了如何對(duì)大腸桿菌進(jìn)行工程改造以產(chǎn)生大量化合物，例如生物燃料、大宗化學(xué)品、天然產(chǎn)物和聚羥基鏈烷酸酯。同樣，酵母細(xì)胞工廠進(jìn)一步擴(kuò)展了可從可再生基質(zhì)生產(chǎn)的目標(biāo)化學(xué)品組合。工程釀酒酵母生產(chǎn)的多種生物基化學(xué)品（例如有機(jī)酸和脂肪酸、生物燃料、類(lèi)異戊二烯、芳烴和聚酮）說(shuō)明了這一點(diǎn)。大多數(shù)這些細(xì)胞工廠的工業(yè)相關(guān)性僅限于原理驗(yàn)證嘗試——除了重組蛋白生產(chǎn)和一些大宗化學(xué)品的生物合成。大規(guī)模發(fā)酵中的高產(chǎn)品滴度和穩(wěn)健性，對(duì)于工業(yè)應(yīng)用同樣必要，但在此類(lèi)試點(diǎn)研究中很少成功實(shí)現(xiàn)。這些性能指標(biāo)與宿主的新陳代謝和生理學(xué)密切相關(guān)，這使得穩(wěn)定生產(chǎn)參數(shù)等性狀難以設(shè)計(jì)。例如，大腸桿菌對(duì)底物和氧氣梯度的敏感性，由于混合限制，在大型生物反應(yīng)器中經(jīng)常遇到，是一個(gè)長(zhǎng)期存在的問(wèn)題，只是部分解決了。同樣，大腸桿菌和酵母的溢出代謝規(guī)定了僅限于低底物濃度的糖喂養(yǎng)政策，并放大了與底物梯度相關(guān)的問(wèn)題。因此，具有獨(dú)特或額外優(yōu)勢(shì)特性的非傳統(tǒng)宿主成為替代微生物候選者，因?yàn)樗鼈冊(cè)谏a(chǎn)特定化合物方面表現(xiàn)出增強(qiáng)的性能，或者因?yàn)樗鼈兛梢缘挚构I(yè)規(guī)模生產(chǎn)中典型的惡劣條件。此外，非傳統(tǒng)宿主能夠使用替代原料，例如 C1 化合物作為 CO2，規(guī)避與其他工業(yè)過(guò)程和食品生產(chǎn)的競(jìng)爭(zhēng)。在許多其他有希望的微生物中，細(xì)菌種類(lèi)天藍(lán)色鏈霉菌、丙酮丁醇梭菌、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌和紅球菌屬，以及真核生物曲霉屬和 Rhodotorula toruloides 屬于非傳統(tǒng)生物生產(chǎn)平臺(tái)的廣泛類(lèi)別。（表格1）說(shuō)明了這些微生物的一些關(guān)鍵特征，例如，它們產(chǎn)生特定類(lèi)型分子的能力、對(duì)有毒化合物和極端培養(yǎng)條件的耐受性、遺傳工具的可用性、底物范圍和快速生長(zhǎng)速度。這些物種已經(jīng)找到了以生物技術(shù)生產(chǎn)大宗和精細(xì)化學(xué)品的方式，無(wú)論是代謝工程菌株的形式，還是通過(guò)長(zhǎng)期選擇性培養(yǎng)計(jì)劃獲得的過(guò)度生產(chǎn)變體的形式。這種類(lèi)型的另一個(gè)突出例子是革蘭氏陰性細(xì)菌惡臭假單胞菌，這都是由于合成生物學(xué)工具的可用性——不斷擴(kuò)大——以及對(duì)化學(xué)和氧化應(yīng)激的顯著耐受性。然而，這些微生物在代謝工程和工業(yè)應(yīng)用方面仍未得到充分利用，因?yàn)樵诨蛐团c表型關(guān)系及其代謝網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)方面存在顯著的知識(shí)差距。擴(kuò)大對(duì)微生物代謝的了解對(duì)于擴(kuò)大可以“馴化”為細(xì)胞工廠的微生物底物的種類(lèi)是必不可少的。在大多數(shù)非傳統(tǒng)微生物中，關(guān)于 DNA 修飾如何影響表型或代謝網(wǎng)絡(luò)如何在幾個(gè)調(diào)節(jié)水平上相互作用的問(wèn)題仍然不清楚。了解基因型與表型之間的關(guān)系需要充分利用合成生物學(xué)工具，實(shí)現(xiàn)合理和靶向的 DNA 修飾，以及全面探索代謝的動(dòng)態(tài)行為，將物理化學(xué)或生化擾動(dòng)與表型變化聯(lián)系起 來(lái)。目前，解決這些挑戰(zhàn)的大多數(shù)努力都集中在開(kāi)發(fā)新的工具來(lái)設(shè)計(jì)非模型微生物。同時(shí)，微生物原型的深入多組學(xué)分析正在為模型生物提供動(dòng)力，允許以前所未有的細(xì)節(jié)探索細(xì)胞中的多個(gè)調(diào)控層。盡管這些策略是必要的，但它們通常不足以調(diào)查非傳統(tǒng)微生物作為生物生產(chǎn)平臺(tái)的潛力——在這種平臺(tái)上，缺乏對(duì)整個(gè)生物實(shí)體的系統(tǒng)理解。因此，合理設(shè)計(jì)、多組分?jǐn)?shù)據(jù)集成、預(yù)測(cè)模型和自動(dòng)化的智能組合對(duì)于構(gòu)建高效的細(xì)胞工廠、擴(kuò)展基礎(chǔ)知識(shí)和指導(dǎo)代謝工程至關(guān)重要。
03
生物鑄造廠利用模型微生物宿主推進(jìn)生物生產(chǎn)
設(shè)計(jì)、建造和測(cè)試電池工廠在工作量、時(shí)間和成本方面都很苛刻。這些活動(dòng)中的大多數(shù)仍以（半）手工的方式沿著被稱(chēng)為合成生物學(xué)設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試-學(xué)習(xí)（DBTL）循環(huán)的迭代工作流程進(jìn)行。生物鑄造廠的出現(xiàn)旨在加速和自動(dòng)化這一序列，同時(shí)提高一致性、通量和降低勞動(dòng)力成本。因此，生物鑄造廠的主要目標(biāo)是簡(jiǎn)化化學(xué)生產(chǎn)的微生物底盤(pán)工程。然而，生物鑄造管道的最終產(chǎn)品，即細(xì)胞工廠，只是一個(gè)工業(yè)級(jí)生物生產(chǎn)平臺(tái)的起點(diǎn)。一個(gè)整合的生物過(guò)程絕不是在那個(gè)階段完成的，而且在升級(jí)階段必須投入大量的時(shí)間和成本，這通常涉及到重新設(shè)計(jì)或升級(jí)細(xì)胞工廠的某些功能，或者選擇完全不同的微生物宿主。幸運(yùn)的是，合成生物學(xué)和多組學(xué)方法學(xué)的最新進(jìn)展為加強(qiáng)生物鑄造廠的作用提供了強(qiáng)有力的框架。在這個(gè)結(jié)構(gòu)中，作者提出了 DBTL 循環(huán)的升級(jí)版本，其中“以代謝為中心” 的觀點(diǎn)——而不是更傳統(tǒng)的以基因組為中心的方法——有助于揭示生物技術(shù)相關(guān)微生物的表型復(fù)雜性。在這里，作者將生物鑄造廠作為一個(gè)自動(dòng)化平臺(tái)來(lái)擴(kuò)展對(duì)非傳統(tǒng)微生物的知識(shí)——以及如何利用這些信息來(lái)定制強(qiáng)大的細(xì)胞工廠。作者還概述了快速構(gòu)建主流宿主和替代宿主的多種突變變體的最新工具箱發(fā)展，重點(diǎn)是下一代宿主 P. putida。在這種情況下，生物鑄造廠被提議作為一個(gè)功能接口，在該接口中，組學(xué)技術(shù)的集成使得幾乎任何微生物底盤(pán)都能得到合理的操縱—— 新陳代謝是這種發(fā)展的核心驅(qū)動(dòng)力——從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞工廠的全自動(dòng)化部署。
04
生物鑄造廠的細(xì)胞工廠設(shè)計(jì)和測(cè)試自動(dòng)化
自動(dòng)化技術(shù)正日益融入合成生物學(xué)和代謝工程。通常，構(gòu)建一個(gè)含有相對(duì)簡(jiǎn)單的合成代謝途徑的細(xì)胞工廠需要至少十個(gè)單獨(dú)的 DNA 模塊。這些遺傳部分必須以多種配置進(jìn)行重新排列，以產(chǎn)生以合理滴度產(chǎn)生所需產(chǎn)物的變體——這使得人工構(gòu)建 DNA 組裝既不切實(shí)際又耗時(shí)。相比之下，自動(dòng)化為細(xì)胞工廠設(shè)計(jì)和建造提供了高效、標(biāo)準(zhǔn)化的解決方案。一個(gè)主要的挑戰(zhàn)是以快速有效的方式測(cè)試植入給定宿主的基因構(gòu)建體的大組合，同時(shí)了解每個(gè)修飾對(duì)最終表型的生物學(xué)意義。生物鑄造廠擁有在由機(jī)器人液體處理器控制的集成分子生物學(xué)設(shè)施中處理大量遺傳構(gòu)建體的能力，結(jié)合高通量分析并由專(zhuān)用軟件支持。DNA 構(gòu)建體快速原型的生物鑄造簡(jiǎn)化方案如圖1A所示。學(xué)術(shù)生物鑄造廠的一個(gè)值得注意的方面是，整個(gè)工作流程仍然沒(méi)有完全自動(dòng)化或在 DBTL 周期的所有級(jí)別進(jìn)行集成。細(xì)胞 工廠建設(shè)中的中間步驟需要廣泛的優(yōu)化，大部分在平臺(tái)外手動(dòng)（至少部分）執(zhí)行。此外，到目前為止，自動(dòng)化在提供關(guān)于新陳代謝的深刻基礎(chǔ)信息方面的能力還沒(méi) 有得到充分利用。
圖1.自動(dòng)化生物鑄造廠微生物生理學(xué)和代謝的基本發(fā)現(xiàn)。（A） 微生物原型自動(dòng)化平臺(tái)的總體方案。機(jī)器人液體處理器組件根據(jù)其功能以不同的顏色或位置顯示。該平臺(tái)包括 PCR 機(jī)（黃色）、電穿孔站（淺藍(lán)色）、培養(yǎng)裝置（綠色）、 分光光度計(jì)（淺紅色）、搬運(yùn)機(jī)械臂（頂部）、尖端盒（白色）和快速過(guò)濾裝置（右側(cè)，淺橙色）。所有這些組件都放在一個(gè)化學(xué)罩中。（B）通過(guò)快速質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒純化、治愈和基因分型介導(dǎo)的自動(dòng)基因組工程。流水線中的不同步驟如下：（i）通過(guò) PCR 從標(biāo)準(zhǔn)零件（標(biāo)準(zhǔn)歐洲載體結(jié)構(gòu)，SEVA）進(jìn)行遺傳零件組裝；（ii）將 PCR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為化學(xué)活性大腸桿菌，隨后進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)；（iii）質(zhì)粒 DNA 純化和轉(zhuǎn)化為非傳統(tǒng)目的宿主；和（iv）單個(gè)克隆的質(zhì)粒固化和基因型檢查。整個(gè)過(guò)程原則上可以在4-5 天內(nèi)完成，并在基本上任何革蘭氏陰性細(xì)菌宿主上產(chǎn)生菌株變體庫(kù)�？s寫(xiě)：OD，光密度；PCR、聚合酶鏈反應(yīng)。
傳統(tǒng)微生物宿主（主要是大腸桿菌）的正向工程在 DBTL 循環(huán)的設(shè)計(jì)-構(gòu)建階段利用了生物鑄造廠的潛力。最近的兩個(gè)例子說(shuō)明了工程大腸桿菌用于（2S）-黃烷酮和十二醇生物生產(chǎn)的半自動(dòng)化方法。第一個(gè)例子是通過(guò)在自動(dòng)化管道中組裝表達(dá)構(gòu)建體的組合文庫(kù)來(lái)優(yōu)化不同類(lèi)黃酮的生物合成過(guò)程�；虿糠直辉O(shè)計(jì)為通過(guò)連接酶循環(huán)反應(yīng)與 DNA 組裝完全兼容，并通過(guò)液體處理機(jī)器人平臺(tái)執(zhí)行計(jì)算機(jī)移液工作流程。應(yīng)用這種半自動(dòng) DBTL 程序，以甘油為原料，獲得了高滴度的柚皮素（484 mg/l）、松脂素（198 mg/l），高滴度（55 mg/l，以咖啡酸酯為原 料）和后莫圣草素（17 mg/l）。在第二個(gè)例子中，使用基因庫(kù)和核糖體結(jié)合位點(diǎn) （RBS）系統(tǒng)地操縱基因表達(dá)強(qiáng)度，用于十二醇生物生產(chǎn)。通過(guò)測(cè)試來(lái)自大腸桿菌 MG1655 的 60 株工程菌株，實(shí)施了兩個(gè)連續(xù)的 DBTL 循環(huán)以增強(qiáng)葡萄糖的產(chǎn)物形成。在第一次迭代中，通過(guò)采用一組預(yù)測(cè)強(qiáng)度不同的 RBS 來(lái)調(diào)節(jié)不同�；� 載體蛋白（ACPs）/�；o酶 A（CoA）還原酶基因的表達(dá)。硫酯酶和�；o酶 A 合成酶基因同樣被納入這些設(shè)計(jì)中。接下來(lái)，將這些實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)濃度和產(chǎn)品產(chǎn)量數(shù)據(jù)輸入機(jī)器學(xué)習(xí)算法，以預(yù)測(cè)進(jìn)一步的優(yōu)化步驟�；谟�(jì)算機(jī)預(yù)測(cè) 的第二次迭代使十二醇滴度（0.83±0.13 g/l）比第一次循環(huán)的基礎(chǔ)菌株提高了21%。重要的是，Opgenorth 及其同事的研究在實(shí)現(xiàn)機(jī)器學(xué)習(xí)算法提出的設(shè)計(jì)時(shí)暴露了缺點(diǎn)。挑戰(zhàn)包括（i）可用RBS對(duì)蛋白質(zhì)含量的可預(yù)測(cè)性有限，（ii）途徑 蛋白的非靶向效應(yīng)（例如 FadD �；�-輔酶 A 合成酶的表觀毒性），（iii）通過(guò)改變 單個(gè) RBS（例如極性）帶來(lái)的整體操縱子效應(yīng)，（iv）當(dāng)使用密切相關(guān)（與完全 組合相反）構(gòu)造的訓(xùn)練集時(shí)，掩蓋整個(gè)數(shù)據(jù)空間中的局部趨勢(shì)，以及（iv）需要大數(shù)據(jù)集來(lái)可靠地訓(xùn)練機(jī)器學(xué)習(xí)路徑。
最近的另一項(xiàng)研究描述了一種半自動(dòng)管道，用于優(yōu)化釀酒酵母工程菌株生產(chǎn)白樺酸（一種五環(huán)三萜）。作者應(yīng)用了 SCRaMbLE，這是一種體內(nèi)誘導(dǎo)的合成染色體缺失系統(tǒng)，目的是生成多樣化的菌株庫(kù)。白樺酸途徑模塊的設(shè)計(jì)和構(gòu)建階段 是手動(dòng)進(jìn)行的，而測(cè)試部分是通過(guò)實(shí)施自動(dòng)化高通量篩選方法來(lái)執(zhí)行的。因此， 該文描述了使用酵母細(xì)胞工廠的全自動(dòng)化生物生產(chǎn)過(guò)程的最接近的例子之一，有可能包含實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化的額外步驟。另一種真菌物種假土曲霉（Aspergillus pseudoterus）已進(jìn)行了深入的、多組學(xué)指導(dǎo)的工程，用于聚合物前體 3-羥基丙酸 （3-HPA）的糖依賴性生物合成——在生物反應(yīng)器培養(yǎng)物中，滴度可達(dá) 0.88±0.11 g/l。該方法基于蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)，鑒定能夠從預(yù)期的 3-HPA 合成途徑排出通量的上調(diào)蛋白。建立了合成β-丙氨酸依賴的產(chǎn)物形成途徑，并通過(guò)刪除負(fù)責(zé) 3-HPA 降解的丙二酸半醛脫氫酶基因（Apald6）重新定向乙酰輔酶 A 通量。
這個(gè)章節(jié)的討論提供了自動(dòng)化潛力的原理示例。這些開(kāi)創(chuàng)性的研究還揭示了一個(gè)事實(shí)，即大體上，模式生物是首選的生物鑄造宿主。只有將細(xì)菌宿主的種類(lèi)大大擴(kuò)展到大腸桿菌之外，特別是生產(chǎn)非普通化學(xué)品，生物鑄造廠的全部潛力才能實(shí)現(xiàn)。這項(xiàng)工作需要一個(gè)自動(dòng)化的管道來(lái)實(shí)現(xiàn)非模型生物的合成工具集，同時(shí)需要組學(xué)驅(qū)動(dòng)的對(duì)其代謝和生理學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)的擴(kuò)展。下一節(jié)將討論生物鑄造廠如何成為這方面的關(guān)鍵參與者。
05
通過(guò)自動(dòng)化和擴(kuò)展合成生物學(xué)工具箱為基于非傳統(tǒng)宿主的細(xì)胞工廠鋪平道路
體內(nèi) DNA 模塊的構(gòu)建和組裝以及從頭途徑設(shè)計(jì)是細(xì)胞工廠開(kāi)發(fā)的重要組成部分。將這些技術(shù)推廣到非傳統(tǒng)宿主可以標(biāo)志著從緩慢馴化到合理設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)變， 克服復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)和有限的微生物生理學(xué)知識(shí)帶來(lái)的障礙。由于物種間的功能不相容性（例如，RecA 介導(dǎo)的重組較差），為生物技術(shù)主流的基因工程建立的方法很難轉(zhuǎn)移到非模型宿主。最近為非模式生物量身定制了一些尖端技術(shù)，但仍有很大的改進(jìn)空間——尤其是在準(zhǔn)確表征這些替代宿主中的工具方面。將非傳統(tǒng)微生物整合到生物鑄造管道中，不僅可以開(kāi)發(fā)出新的（潛在的，更高級(jí)的）細(xì)胞工廠， 而且還將刺激對(duì)這些宿主的基礎(chǔ)研究。生物鑄造廠可以生產(chǎn)大量的表型和組學(xué)數(shù)據(jù)，如果這些數(shù)據(jù)被廣泛提供給科學(xué)界，將成為學(xué)術(shù)界和工業(yè)界研究的指導(dǎo)資源。對(duì)新分離的微生物及其工具箱進(jìn)行表征，這項(xiàng)過(guò)去需要幾十年的努力，現(xiàn)在可以簡(jiǎn)化并以很小的時(shí)間和成本進(jìn)行。稍后將討論假單胞菌的基因組工程，以說(shuō)明生物鑄造廠在實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)方面可能發(fā)揮的作用。
工具箱優(yōu)化和大規(guī)模復(fù)用是 DBTL 周期構(gòu)建階段的兩個(gè)重要方面，以釋放非傳統(tǒng)主機(jī)作為單元工廠的潛力。假單胞菌基因組工程已經(jīng)針對(duì)手動(dòng)工作流程進(jìn) 行了優(yōu)化，但它可以進(jìn)一步發(fā)展為自動(dòng)化設(shè)置。到目前為止，最快的惡臭假單胞菌基因缺失方案需要將自殺質(zhì)粒共整合到感興趣的位點(diǎn)中。整合位點(diǎn)和要切除的區(qū)域由自殺質(zhì)粒中兩個(gè)同源臂（HA）的序列決定；用戶可以自由選擇這些臂來(lái)介導(dǎo)細(xì)菌染色體中幾乎任何位置的同源重組（HR）事件。通過(guò)在 HA 中加入遺傳元素，這些特征同樣可以整合到目標(biāo)基因座中。通過(guò)從輔助質(zhì)粒表達(dá)基因而反 式提供的 I-SceI 歸巢巨核酸酶引入雙鏈 DNA 斷裂，從而迫使第二個(gè) HR 事件從基因組中移除質(zhì)粒骨架和靶區(qū)。通過(guò)將質(zhì)粒復(fù)制的合成控制納入所謂的 pQURE 質(zhì)粒工具集，這一策略得到了升級(jí)，通過(guò)向培養(yǎng)基中添加 3-甲基苯甲酸鹽，可以 嚴(yán)格控制質(zhì)粒的繁殖。然而，這些方法的潛力有待充分挖掘。例如，自動(dòng)化可以用于在幾輪迭代中生成大型構(gòu)造庫(kù)。為此，可以采用克隆標(biāo)準(zhǔn)，例如標(biāo)準(zhǔn)歐洲向量架構(gòu)（SEVA），以模塊化方式組裝復(fù)雜回路，從而產(chǎn)生與許多革蘭氏陰性宿主兼容的廣泛宿主范圍構(gòu)建體，同時(shí)促進(jìn)遺傳部分的可重用性。在這里，作者提出了一個(gè)通過(guò)自動(dòng)化和并行化相結(jié)合的非傳統(tǒng)革蘭氏陰性菌快速基因組工程的原型工作流（圖1B）。該工作流程包括（i）遵循標(biāo)準(zhǔn)的模塊化 DNA 部分的平行和自動(dòng)組裝、（ii）用組裝的構(gòu)建體對(duì)大腸桿菌進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，（iii）高通量純化質(zhì)粒 DNA 并用質(zhì)粒文庫(kù)轉(zhuǎn)化所需宿主，隨后（iv）用自固化 pQURE 載體轉(zhuǎn)化并對(duì)所得無(wú)質(zhì)粒菌株變體進(jìn)行基因分型。該工作流程中的所有步驟都可以通過(guò)集成在機(jī)器人平臺(tái)中的自動(dòng)液體處理器輕松控制。
雖然已知該工作流程中提到的所有技術(shù)都可單獨(dú)應(yīng)用于 P.putida，但需要對(duì)其他宿主中的功能元件和部件（例如抗生素標(biāo)記、基因表達(dá)系統(tǒng)、HR 機(jī)制和效率、轉(zhuǎn)化方案和反選擇標(biāo)記）進(jìn)行快速和自動(dòng)原型設(shè)計(jì)，以驗(yàn)證其性能�？墒褂脧V泛使用的技術(shù)（例如，USER 克隆、Golden Gate 克隆、Gibson 組裝或 SureVector） 組裝此類(lèi)管道中使用的質(zhì)粒，并且根據(jù)所選擇的方法，自動(dòng)化協(xié)議最近已經(jīng)可用。按照標(biāo)準(zhǔn)化的克隆策略，一旦創(chuàng)建了大多數(shù)部分，就可以重新用于多種構(gòu)建體——例如質(zhì)粒主干。鑒于整合質(zhì)粒中作為 HA 所需的特定 PCR 擴(kuò)增子大小相等（約 500 bp），而不考慮靶點(diǎn)，這些 HA 可以以高通量方式獲得，例如 96 孔板（圖 1B 中的步驟 1）。對(duì)于許多克隆策略，DNA 片段的組裝可以在相同的布局中進(jìn)行， 甚至無(wú)需事先純化。一旦質(zhì)粒組裝好，它們就以 96 孔電穿孔板形式轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行繁殖（圖 1B 中的步驟 2）。通過(guò)克隆 PCR 和 Sanger 測(cè)序驗(yàn)證質(zhì)粒的正確 性。再次，使用標(biāo)準(zhǔn)化引物集進(jìn)行驗(yàn)證，這樣這一步驟也可以自動(dòng)化。由于 Sanger 測(cè)序價(jià)格合理，克隆效率通常很高，這種方法既具有經(jīng)濟(jì)競(jìng)爭(zhēng)力，又快速，因?yàn)椴恍枰?DNA 純化或凝膠電泳，從而實(shí)現(xiàn)高通量。圖1B 中的步驟 3 說(shuō)明了使用 市售 DNA 提取試劑盒以 96 孔板形式純化質(zhì)粒。然后通過(guò)電穿孔、化學(xué)轉(zhuǎn)化或綴合將純化的質(zhì)粒引入感興趣的（非傳統(tǒng)）宿主中，回收后，將細(xì)胞接種到選擇性培養(yǎng)基上以選擇亞倍體。請(qǐng)注意，將細(xì)菌懸浮液分散到選擇性瓊脂平板上以分離單個(gè)菌落是序列中的關(guān)鍵步驟，但基本上沒(méi)有實(shí)現(xiàn)這一目的的全自動(dòng)化、高效的方案。該方案的最后一部分（圖 1B 中的步驟 4）涉及通過(guò)在亞二倍體克隆中引入 pQURE 系統(tǒng)來(lái)強(qiáng)制第二次HR事件，然后進(jìn)行質(zhì)粒固化�？梢允褂藐幮赃x擇標(biāo)記（例如，sacB）來(lái)促進(jìn)質(zhì)粒消除，從而實(shí)現(xiàn)更高的產(chǎn)量。序列的最后一步是通過(guò)克隆 PCR 和 Sanger 測(cè)序進(jìn)行基因型確認(rèn)，如質(zhì)粒構(gòu)建階段所示。此時(shí)， 菌株庫(kù)已準(zhǔn)備好進(jìn)入測(cè)試階段，即多組學(xué)方法促進(jìn)的代謝網(wǎng)絡(luò)分析。
06
引入以代謝為中心的分析作為發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，指導(dǎo) DBTL 循環(huán)中的工程工作
采用非模式生物作為底盤(pán)的主要挑戰(zhàn)不僅是基因工程工具的相對(duì)缺乏—— 這可以通過(guò)實(shí)施上一節(jié)中建議的管道部分解決——而且關(guān)于代謝結(jié)構(gòu)及其調(diào)控的信息有限。因此，需要對(duì)不同環(huán)境條件下的代謝進(jìn)行詳細(xì)分析，例如遺傳或化學(xué)干擾，以了解代謝結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)。反過(guò)來(lái)，這些信息可以用于確定與生物技術(shù)相關(guān)的可行代謝景觀。與自動(dòng)化和合成生物學(xué)協(xié)同提高細(xì)胞工廠建設(shè)的速度和產(chǎn)量一樣，自動(dòng)化與多組學(xué)分析相結(jié)合可以擴(kuò)展對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)的知識(shí)。在計(jì)算數(shù)據(jù)集成的支持下，用于系統(tǒng)生物學(xué)目的的多組學(xué)已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，這允許全面理解跨多組學(xué)層的代謝網(wǎng)絡(luò)。多種檢測(cè)和測(cè)量技術(shù)可用于捕獲基因型-表型之間的信息，包括 DNA 和 RNA 測(cè)序（即基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)）、基于質(zhì)譜（MS）的代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和通量組學(xué)以及核磁共振。圖 2 以加速基因組工程、多組學(xué)分析和自動(dòng)化相結(jié)合的中心思想為基礎(chǔ)，為 DBTL 循環(huán)提供支持，同時(shí)解決微生物代謝的基本問(wèn)題。
圖 2.以代謝為中心的合成生物學(xué)設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試-學(xué)習(xí)循環(huán)方法，由深度多組學(xué)分析支持。該圖從左至右描繪了在快速基因組工程、多組學(xué)分析和自動(dòng)化支持下，在探索非傳統(tǒng)宿主代謝結(jié)構(gòu)的基本方面時(shí)指導(dǎo)工程步驟的一般策略。
這種類(lèi)型的多組學(xué)分析體現(xiàn)在代謝中心觀點(diǎn)在不同微生物中的一些應(yīng)用中。不足為奇的是，其中兩個(gè)例子中采用了一種因其多功能和復(fù)雜的代謝而被廣泛認(rèn)可的非傳統(tǒng)宿主——P.putida。該文討論的實(shí)例包含了對(duì)（i）δ-戊內(nèi)酰胺（哌啶 -2-酮）作為唯一碳源的利用和ε-己內(nèi)酰胺（氮雜環(huán)己內(nèi)酰胺）的分解代謝，以 及（ii）復(fù)雜的脂肪酸和酒精代謝的多組學(xué)探索。在第一個(gè)例子中，作者通過(guò)使用隨機(jī)條形碼轉(zhuǎn)座子測(cè)序（RB-TnSeq）和鳥(niǎo)槍蛋白質(zhì)組學(xué)的組合來(lái)研究δ-戊內(nèi)酰胺分解代謝，以提高內(nèi)酰胺滴度。一個(gè)特定位點(diǎn)（oplBA）被鑒定為編碼負(fù)責(zé)啟動(dòng)δ-戊內(nèi)酰胺分解的功能。接下來(lái)，刪除 oplBA 基因以防止δ-戊內(nèi)酰胺在富培養(yǎng)基中降解，這也減少了ε-己內(nèi)酰胺的消耗。然后，使用關(guān)鍵代謝前體（即 L-賴氨酸或5-氨基戊酸）的途徑也被刪除，使得δ-戊內(nèi)酰胺滴度從檢測(cè)不到的顯著增加到約 90 mg/L。在第二個(gè)例子中，RB-TnSeq 技術(shù)被用于為參與脂肪酸和酒精分解代謝的酶分配功能迄今其作用原理未知。通過(guò)序列同源性將功能分配給孤兒酶可能極具挑戰(zhàn)性，因?yàn)樵S多假定的旁系基因編碼相似的活性，可以共存，同時(shí)顯示不同的調(diào)控模式。在這種情況下，在對(duì)不同脂肪酸和醇作為唯一碳源的轉(zhuǎn)座子文庫(kù)進(jìn)行深度適應(yīng)度分析后，強(qiáng)表型可追溯到數(shù)百個(gè)基因。根據(jù)在不同鏈長(zhǎng)的脂肪酸上培養(yǎng)突變體池的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)推斷酶底物偏好。一個(gè)特定的蛋白質(zhì)家族，稱(chēng)為 DUF1302/DUF1329，被假設(shè)起酯酶的作用。此外，還發(fā)現(xiàn)了異戊醇（3-甲基丁烯-3-烯-1-醇，一種半萜醇）和異戊醇（3-乙基丁-1-醇）分解代謝的新途徑。這些醇被提議在初始氧化步驟和通過(guò) CoA 連接活化后通過(guò) L-亮氨酸代謝分解。由于脂肪酸和醇都是生產(chǎn)重要生物產(chǎn)品的關(guān)鍵前體，這項(xiàng)研究的結(jié)果必將指導(dǎo)未來(lái)的菌株設(shè)計(jì)。
細(xì)胞工廠構(gòu)建過(guò)程中的代謝中心觀點(diǎn)也體現(xiàn)在腔色鏈球菌產(chǎn)生聚酮抗生素放線素的過(guò)程中。在這里，基于代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的分析表明，環(huán)腺苷酸 （cAMP）濃度與放線素生物合成密切相關(guān)，這似乎是一種調(diào)節(jié)性、多效性效應(yīng)， 而不是直接的前體喂養(yǎng)。這一初步跡象導(dǎo)致作者在培養(yǎng)基中補(bǔ)充 cAMP。隨后的多組學(xué)分析表明，補(bǔ)充 cAMP 后，鳥(niǎo)嘌呤濃度增加。通過(guò)使用胍類(lèi)似物7-甲基鳥(niǎo) 嘌呤抑制了胍依賴性反應(yīng)，這排除了 cAMP 的積極作用，表明同源反應(yīng)介導(dǎo)了細(xì)菌生長(zhǎng)和抗生素生產(chǎn)的積極作用。
最后，通過(guò)自動(dòng)化將細(xì)胞工廠建設(shè)推向下一個(gè)水平的以代謝為中心的方法可 以依賴于將細(xì)菌生長(zhǎng)與感興趣分子的生物合成耦合，或?qū)⒆罱K促進(jìn)生物質(zhì)形成的多個(gè)代謝模塊耦合。攜帶生長(zhǎng)耦合模塊的菌株可以通過(guò)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化（ALE）進(jìn)化，以改進(jìn)表型豐富種群。這種方法將顯著減少篩選時(shí)間，因?yàn)樽R(shí)別高產(chǎn)量變體的參數(shù)是細(xì)菌生長(zhǎng)。這種策略在構(gòu)建細(xì)胞工廠以生物合成難以生產(chǎn)的化合物時(shí)尤其有用，例如鹵化分子，這些化合物需要大量的分析工作來(lái)檢測(cè)和定量。
07
觀點(diǎn)總結(jié)和未來(lái)方向
生物鑄造廠是在生物工業(yè)的框架內(nèi)出現(xiàn)的，以加速細(xì)胞工廠的發(fā)展。優(yōu)化工作流程，為可持續(xù)化工生產(chǎn)建立高性能、工業(yè)級(jí)微生物平臺(tái)，是現(xiàn)有生物鑄造廠的座右銘，無(wú)論是在工業(yè)界還是學(xué)術(shù)界。然而，利用生物鑄造廠的生產(chǎn)能力和概念框架 來(lái)獲得微生物生理學(xué)和代謝的基本知識(shí)，進(jìn)而將這些信息反饋到工作流程中，以支持細(xì)胞工廠設(shè)計(jì)，這一潛力尚未得到開(kāi)發(fā)。同樣，重新編程也為進(jìn)一步深入了解生命系統(tǒng)的復(fù)雜性提供了基礎(chǔ)性的見(jiàn)解，為后續(xù)的工程設(shè)計(jì)提供了動(dòng)力。這一概念將有助于為生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)重新編程細(xì)胞建立通用（而非生物特定）生物設(shè)計(jì)規(guī)則。
自動(dòng)化是這些發(fā)展的關(guān)鍵，但并非沒(méi)有挑戰(zhàn)。為了使整個(gè)實(shí)驗(yàn)室工作流程自動(dòng)化，管道中實(shí)施的協(xié)議必須一致，提供精確的量化并確保再現(xiàn)性。盡管支持技術(shù)越來(lái)越可靠，但仍有很大的改進(jìn)空間，因?yàn)樵谙到y(tǒng)或多或少獨(dú)立運(yùn)行之前，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化例程仍然需要耗時(shí)的優(yōu)化。與這些努力相結(jié)合，多元組學(xué)分析也帶來(lái)了一些障礙。很明顯，過(guò)去的學(xué)習(xí)在目標(biāo)分子和微生物宿主之間并沒(méi)有很好地傳遞， 而且實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)集的質(zhì)量、數(shù)量和一致性往往不足，無(wú)法從中學(xué)習(xí)，即使是大腸桿菌或酵母。因此，數(shù)據(jù)管理至關(guān)重要，因?yàn)樯疃群透咄糠治鰰?huì)產(chǎn)生大量數(shù)據(jù)集。由于這些不一致性，多組分?jǐn)?shù)據(jù)集成相當(dāng)具有挑戰(zhàn)性，在開(kāi)放獲取環(huán)境中跨生物鑄造廠的數(shù)據(jù)比較將至關(guān)重要。幸運(yùn)的是，已經(jīng)建立了一些計(jì)算工具以及統(tǒng)計(jì)工具箱來(lái)支持這些發(fā)展。如上述的一些示例所示，由于機(jī)器學(xué)習(xí)的預(yù)測(cè)能力，它也成為合成生物學(xué)的堅(jiān)實(shí)支柱。
作者認(rèn)為，為該文所述目的調(diào)整生物鑄造廠可以以相對(duì)簡(jiǎn)單的方式完成。在持續(xù)的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒 2（SARS-CoV-2）大流行期間，生物鑄造廠的多功能性已成為一個(gè)明顯的例子，因?yàn)樾l(wèi)生危機(jī)暴露了創(chuàng)新和快速適應(yīng)的生物技術(shù)方法對(duì)抵消其影響的重要性。迅速調(diào)整現(xiàn)有科學(xué)基礎(chǔ)設(shè)施和勞動(dòng)力的用途， 從而開(kāi)發(fā)出安全有效的候選疫苗。按照同樣的推理，可以預(yù)期，重新啟動(dòng)生物鑄造廠以支持基本發(fā)現(xiàn)將擴(kuò)大對(duì)非傳統(tǒng)微生物固有代謝復(fù)雜性的現(xiàn)有理解。因此， 在 DBTL循環(huán)中應(yīng)用以代謝為中心的層將在未來(lái)通過(guò)生物合成途徑獲得化學(xué)物質(zhì)來(lái)升級(jí)工業(yè)生物技術(shù)，而到目前為止，這些化學(xué)物質(zhì)已超出常用細(xì)胞工廠的生物學(xué)范圍。盡管仍有一些挑戰(zhàn)有待解決（見(jiàn)未決問(wèn)題），但該文中提出的一些解決方案可能有助于在急需替代石油生產(chǎn)（受到各種政治和經(jīng)濟(jì)影響）的時(shí)候鞏固生物經(jīng)濟(jì)。
08
未解決的問(wèn)題
非傳統(tǒng)宿主中復(fù)雜（和有利）細(xì)胞性狀的生化和遺傳基礎(chǔ)是什么？
合成生物學(xué)能否實(shí)現(xiàn)這些特性的正向工程？
生物鑄造廠會(huì)根據(jù)預(yù)期應(yīng)用以及大量的底盤(pán)集來(lái)選擇最合適的宿主嗎？
自動(dòng)化是否可以通過(guò)便利通常耗時(shí)的協(xié)議來(lái)推動(dòng)處理代謝工程的方式的革命？
這些以代謝為中心的自動(dòng)化序列在多大程度上有助于在實(shí)際工業(yè)規(guī)模上部署非傳統(tǒng)細(xì)胞工廠？
全文完
參考文獻(xiàn)：Gurdo N, Volke DC, Nikel PI. Merging automation and fundamental discovery into the design-build-test-learn cycle of nontraditional microbes. Trends in Biotechnology. 2022;40(10):1148-59.
Mediacenter Editor | 曼森編輯
文章來(lái)源：本文由中科院上海生命科學(xué)信息中心與曼森生物合作供稿
排版校對(duì)：劉娟娟編輯
內(nèi)容審核：郝玉有博士
本期推文編譯了 Gurdo N 等發(fā)表在 Trends in Biotechnology 期刊上的綜述《將自動(dòng)化和基本發(fā)現(xiàn)融入非傳統(tǒng)微生物的設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試-學(xué)習(xí)循環(huán)》（Merging automation and fundamental discovery into the design-build-test-learn cycle of nontraditional microbes），該文作者提出了一種“以代謝為中心”的合成生物學(xué)設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試-學(xué)習(xí)循環(huán)的方法，并得到多組學(xué)分析的支持。
目錄/CONTENT
01/要點(diǎn)
02/用于生物生產(chǎn)的傳統(tǒng)和新興微生物平臺(tái)的調(diào)查
03/生物鑄造廠利用模型微生物宿主推進(jìn)生物生產(chǎn)
04/生物鑄造廠的細(xì)胞工廠設(shè)計(jì)和測(cè)試自動(dòng)化
05/通過(guò)自動(dòng)化和擴(kuò)展合成生物學(xué)工具箱，為基于非傳統(tǒng)宿主的細(xì)胞工廠鋪平道路
06/引入以代謝為中心的分析作為發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，指導(dǎo) DBTL 循環(huán)中的工程工作
07/觀點(diǎn)總結(jié)和未來(lái)方向
08/未解決的問(wèn)題
生物基工業(yè)的重大進(jìn)展使多種化學(xué)品的生物生產(chǎn)具有成本效益，但成功的工業(yè)過(guò)程相對(duì)稀缺，并且僅限于使用少數(shù)主力微生物作為宿主。深入了解非傳統(tǒng)微生物的生理學(xué)和代謝是釋放其生物技術(shù)潛力的關(guān)鍵。生物鑄造廠的誕生使構(gòu)建和測(cè)試大量為生物生產(chǎn)量身定制的微生物菌株的能力成倍增加——作者認(rèn)為其中的自動(dòng)化工作流程可以適應(yīng)獲得非傳統(tǒng)宿主的基本知識(shí)。在這里，作者提出了一種“以代謝為中心”的合成生物學(xué)設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試-學(xué)習(xí)循環(huán)的方法，并得到多組學(xué)分析的支持。
01
要點(diǎn)
由于合成生物學(xué)工具集和基礎(chǔ)知識(shí)有限，用于生物生產(chǎn)的非傳統(tǒng)宿主仍未得到充分開(kāi)發(fā)。多組學(xué)方法能夠?qū)ξ⑸锎x進(jìn)行系統(tǒng)級(jí)理解——將工程工作作為設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試-學(xué)習(xí) (DBTL：design–build–test–learn) 循環(huán)的基本要素來(lái)指導(dǎo)。生物鑄造廠能夠在創(chuàng)紀(jì)錄的時(shí)間內(nèi)生成和測(cè)試數(shù)百種微生物菌株——但對(duì)常見(jiàn)和非傳統(tǒng)宿主代謝特征的探索并未完全納入管道。自動(dòng)化在合成生物學(xué)和代謝工程中發(fā)揮著核心作用，除了減少工作流程時(shí)間外，還可以用作指導(dǎo)工程工作的發(fā)現(xiàn)工具。DBTL 循環(huán)中以代謝為中心的觀點(diǎn)有望加速細(xì)胞工廠組裝工作流程，同時(shí)提供有關(guān)基本生物學(xué)問(wèn)題的關(guān)鍵信息。
02
用于生物生產(chǎn)的傳統(tǒng)和新興微生物平臺(tái)的調(diào)查
可持續(xù)化學(xué)生產(chǎn)在不斷發(fā)展的生物基行業(yè)中占據(jù)了穩(wěn)固的地位，以替代目前幾乎完全來(lái)自化石資源的產(chǎn)品。生物底盤(pán)是使用代謝工程工具定制的，該工具產(chǎn)生多功能生物生產(chǎn)平臺(tái)（即細(xì)胞工廠），用于合成廣泛的大宗和精細(xì)化學(xué)品——支持更可持續(xù)、更綠色的社會(huì)。盡管對(duì)高價(jià)值（生物）產(chǎn)品的需求不斷增長(zhǎng)，繼續(xù)以前所未有的速度加速細(xì)胞工廠的發(fā)展，但為生物生產(chǎn)創(chuàng)建強(qiáng)大的微生物平臺(tái)是一項(xiàng)相對(duì)手工且耗時(shí)的工作。此外，難以合成的化合物——無(wú)論是由于其毒性還是因?yàn)樗鼈兪切碌淖匀晃镔|(zhì)，沒(méi)有可用于合成的天然生物催化劑，仍在等待大規(guī)模生產(chǎn)。實(shí)現(xiàn)這一目的的工程細(xì)胞工廠需要一個(gè)多步驟的設(shè)計(jì)和執(zhí)行策略，從生化網(wǎng)絡(luò)的計(jì)算機(jī)模擬到與規(guī)模相關(guān)的生物反應(yīng)器中所需代謝物的實(shí)際生物生產(chǎn)。整個(gè)過(guò)程所需的時(shí)間跨度取決于幾個(gè)方面；首先，用于選定宿主基因組工程的遺傳元件（即部分）的可用性和可及性；其次，評(píng)估包含實(shí)驗(yàn)室規(guī)模生物生產(chǎn)所需修改的初始原型；最后，優(yōu)化不同的參數(shù)以增加滴度并最大化目標(biāo)化合物的通量以及生物工藝放大。在滿足與工業(yè)規(guī)模生物生產(chǎn)兼容的關(guān)鍵性能參數(shù) 之前，此序列的迭代對(duì)于提高工程底盤(pán)的性能是必要的。
革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌和酵母釀酒酵母是常規(guī)用于構(gòu)建細(xì)胞工廠的常規(guī)底盤(pán)。對(duì)其生理學(xué)和遺傳學(xué)的深入了解，以及廣泛的遺傳工具的可用性，使這些微生物在爭(zhēng)取最佳生物生產(chǎn)平臺(tái)的競(jìng)賽中處于領(lǐng)先地位。許多例子展示了如何對(duì)大腸桿菌進(jìn)行工程改造以產(chǎn)生大量化合物，例如生物燃料、大宗化學(xué)品、天然產(chǎn)物和聚羥基鏈烷酸酯。同樣，酵母細(xì)胞工廠進(jìn)一步擴(kuò)展了可從可再生基質(zhì)生產(chǎn)的目標(biāo)化學(xué)品組合。工程釀酒酵母生產(chǎn)的多種生物基化學(xué)品（例如有機(jī)酸和脂肪酸、生物燃料、類(lèi)異戊二烯、芳烴和聚酮）說(shuō)明了這一點(diǎn)。大多數(shù)這些細(xì)胞工廠的工業(yè)相關(guān)性僅限于原理驗(yàn)證嘗試——除了重組蛋白生產(chǎn)和一些大宗化學(xué)品的生物合成。大規(guī)模發(fā)酵中的高產(chǎn)品滴度和穩(wěn)健性，對(duì)于工業(yè)應(yīng)用同樣必要，但在此類(lèi)試點(diǎn)研究中很少成功實(shí)現(xiàn)。這些性能指標(biāo)與宿主的新陳代謝和生理學(xué)密切相關(guān)，這使得穩(wěn)定生產(chǎn)參數(shù)等性狀難以設(shè)計(jì)。例如，大腸桿菌對(duì)底物和氧氣梯度的敏感性，由于混合限制，在大型生物反應(yīng)器中經(jīng)常遇到，是一個(gè)長(zhǎng)期存在的問(wèn)題，只是部分解決了。同樣，大腸桿菌和酵母的溢出代謝規(guī)定了僅限于低底物濃度的糖喂養(yǎng)政策，并放大了與底物梯度相關(guān)的問(wèn)題。因此，具有獨(dú)特或額外優(yōu)勢(shì)特性的非傳統(tǒng)宿主成為替代微生物候選者，因?yàn)樗鼈冊(cè)谏a(chǎn)特定化合物方面表現(xiàn)出增強(qiáng)的性能，或者因?yàn)樗鼈兛梢缘挚构I(yè)規(guī)模生產(chǎn)中典型的惡劣條件。此外，非傳統(tǒng)宿主能夠使用替代原料，例如 C1 化合物作為 CO2，規(guī)避與其他工業(yè)過(guò)程和食品生產(chǎn)的競(jìng)爭(zhēng)。在許多其他有希望的微生物中，細(xì)菌種類(lèi)天藍(lán)色鏈霉菌、丙酮丁醇梭菌、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌和紅球菌屬，以及真核生物曲霉屬和 Rhodotorula toruloides 屬于非傳統(tǒng)生物生產(chǎn)平臺(tái)的廣泛類(lèi)別。（表格1）說(shuō)明了這些微生物的一些關(guān)鍵特征，例如，它們產(chǎn)生特定類(lèi)型分子的能力、對(duì)有毒化合物和極端培養(yǎng)條件的耐受性、遺傳工具的可用性、底物范圍和快速生長(zhǎng)速度。這些物種已經(jīng)找到了以生物技術(shù)生產(chǎn)大宗和精細(xì)化學(xué)品的方式，無(wú)論是代謝工程菌株的形式，還是通過(guò)長(zhǎng)期選擇性培養(yǎng)計(jì)劃獲得的過(guò)度生產(chǎn)變體的形式。這種類(lèi)型的另一個(gè)突出例子是革蘭氏陰性細(xì)菌惡臭假單胞菌，這都是由于合成生物學(xué)工具的可用性——不斷擴(kuò)大——以及對(duì)化學(xué)和氧化應(yīng)激的顯著耐受性。然而，這些微生物在代謝工程和工業(yè)應(yīng)用方面仍未得到充分利用，因?yàn)樵诨蛐团c表型關(guān)系及其代謝網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)方面存在顯著的知識(shí)差距。擴(kuò)大對(duì)微生物代謝的了解對(duì)于擴(kuò)大可以“馴化”為細(xì)胞工廠的微生物底物的種類(lèi)是必不可少的。在大多數(shù)非傳統(tǒng)微生物中，關(guān)于 DNA 修飾如何影響表型或代謝網(wǎng)絡(luò)如何在幾個(gè)調(diào)節(jié)水平上相互作用的問(wèn)題仍然不清楚。了解基因型與表型之間的關(guān)系需要充分利用合成生物學(xué)工具，實(shí)現(xiàn)合理和靶向的 DNA 修飾，以及全面探索代謝的動(dòng)態(tài)行為，將物理化學(xué)或生化擾動(dòng)與表型變化聯(lián)系起 來(lái)。目前，解決這些挑戰(zhàn)的大多數(shù)努力都集中在開(kāi)發(fā)新的工具來(lái)設(shè)計(jì)非模型微生物。同時(shí)，微生物原型的深入多組學(xué)分析正在為模型生物提供動(dòng)力，允許以前所未有的細(xì)節(jié)探索細(xì)胞中的多個(gè)調(diào)控層。盡管這些策略是必要的，但它們通常不足以調(diào)查非傳統(tǒng)微生物作為生物生產(chǎn)平臺(tái)的潛力——在這種平臺(tái)上，缺乏對(duì)整個(gè)生物實(shí)體的系統(tǒng)理解。因此，合理設(shè)計(jì)、多組分?jǐn)?shù)據(jù)集成、預(yù)測(cè)模型和自動(dòng)化的智能組合對(duì)于構(gòu)建高效的細(xì)胞工廠、擴(kuò)展基礎(chǔ)知識(shí)和指導(dǎo)代謝工程至關(guān)重要。
03
生物鑄造廠利用模型微生物宿主推進(jìn)生物生產(chǎn)
設(shè)計(jì)、建造和測(cè)試電池工廠在工作量、時(shí)間和成本方面都很苛刻。這些活動(dòng)中的大多數(shù)仍以（半）手工的方式沿著被稱(chēng)為合成生物學(xué)設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試-學(xué)習(xí)（DBTL）循環(huán)的迭代工作流程進(jìn)行。生物鑄造廠的出現(xiàn)旨在加速和自動(dòng)化這一序列，同時(shí)提高一致性、通量和降低勞動(dòng)力成本。因此，生物鑄造廠的主要目標(biāo)是簡(jiǎn)化化學(xué)生產(chǎn)的微生物底盤(pán)工程。然而，生物鑄造管道的最終產(chǎn)品，即細(xì)胞工廠，只是一個(gè)工業(yè)級(jí)生物生產(chǎn)平臺(tái)的起點(diǎn)。一個(gè)整合的生物過(guò)程絕不是在那個(gè)階段完成的，而且在升級(jí)階段必須投入大量的時(shí)間和成本，這通常涉及到重新設(shè)計(jì)或升級(jí)細(xì)胞工廠的某些功能，或者選擇完全不同的微生物宿主。幸運(yùn)的是，合成生物學(xué)和多組學(xué)方法學(xué)的最新進(jìn)展為加強(qiáng)生物鑄造廠的作用提供了強(qiáng)有力的框架。在這個(gè)結(jié)構(gòu)中，作者提出了 DBTL 循環(huán)的升級(jí)版本，其中“以代謝為中心” 的觀點(diǎn)——而不是更傳統(tǒng)的以基因組為中心的方法——有助于揭示生物技術(shù)相關(guān)微生物的表型復(fù)雜性。在這里，作者將生物鑄造廠作為一個(gè)自動(dòng)化平臺(tái)來(lái)擴(kuò)展對(duì)非傳統(tǒng)微生物的知識(shí)——以及如何利用這些信息來(lái)定制強(qiáng)大的細(xì)胞工廠。作者還概述了快速構(gòu)建主流宿主和替代宿主的多種突變變體的最新工具箱發(fā)展，重點(diǎn)是下一代宿主 P. putida。在這種情況下，生物鑄造廠被提議作為一個(gè)功能接口，在該接口中，組學(xué)技術(shù)的集成使得幾乎任何微生物底盤(pán)都能得到合理的操縱—— 新陳代謝是這種發(fā)展的核心驅(qū)動(dòng)力——從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞工廠的全自動(dòng)化部署。
04
生物鑄造廠的細(xì)胞工廠設(shè)計(jì)和測(cè)試自動(dòng)化
自動(dòng)化技術(shù)正日益融入合成生物學(xué)和代謝工程。通常，構(gòu)建一個(gè)含有相對(duì)簡(jiǎn)單的合成代謝途徑的細(xì)胞工廠需要至少十個(gè)單獨(dú)的 DNA 模塊。這些遺傳部分必須以多種配置進(jìn)行重新排列，以產(chǎn)生以合理滴度產(chǎn)生所需產(chǎn)物的變體——這使得人工構(gòu)建 DNA 組裝既不切實(shí)際又耗時(shí)。相比之下，自動(dòng)化為細(xì)胞工廠設(shè)計(jì)和建造提供了高效、標(biāo)準(zhǔn)化的解決方案。一個(gè)主要的挑戰(zhàn)是以快速有效的方式測(cè)試植入給定宿主的基因構(gòu)建體的大組合，同時(shí)了解每個(gè)修飾對(duì)最終表型的生物學(xué)意義。生物鑄造廠擁有在由機(jī)器人液體處理器控制的集成分子生物學(xué)設(shè)施中處理大量遺傳構(gòu)建體的能力，結(jié)合高通量分析并由專(zhuān)用軟件支持。DNA 構(gòu)建體快速原型的生物鑄造簡(jiǎn)化方案如圖1A所示。學(xué)術(shù)生物鑄造廠的一個(gè)值得注意的方面是，整個(gè)工作流程仍然沒(méi)有完全自動(dòng)化或在 DBTL 周期的所有級(jí)別進(jìn)行集成。細(xì)胞 工廠建設(shè)中的中間步驟需要廣泛的優(yōu)化，大部分在平臺(tái)外手動(dòng)（至少部分）執(zhí)行。此外，到目前為止，自動(dòng)化在提供關(guān)于新陳代謝的深刻基礎(chǔ)信息方面的能力還沒(méi) 有得到充分利用。
傳統(tǒng)微生物宿主（主要是大腸桿菌）的正向工程在 DBTL 循環(huán)的設(shè)計(jì)-構(gòu)建階段利用了生物鑄造廠的潛力。最近的兩個(gè)例子說(shuō)明了工程大腸桿菌用于（2S）-黃烷酮和十二醇生物生產(chǎn)的半自動(dòng)化方法。第一個(gè)例子是通過(guò)在自動(dòng)化管道中組裝表達(dá)構(gòu)建體的組合文庫(kù)來(lái)優(yōu)化不同類(lèi)黃酮的生物合成過(guò)程�；虿糠直辉O(shè)計(jì)為通過(guò)連接酶循環(huán)反應(yīng)與 DNA 組裝完全兼容，并通過(guò)液體處理機(jī)器人平臺(tái)執(zhí)行計(jì)算機(jī)移液工作流程。應(yīng)用這種半自動(dòng) DBTL 程序，以甘油為原料，獲得了高滴度的柚皮素（484 mg/l）、松脂素（198 mg/l），高滴度（55 mg/l，以咖啡酸酯為原 料）和后莫圣草素（17 mg/l）。在第二個(gè)例子中，使用基因庫(kù)和核糖體結(jié)合位點(diǎn) （RBS）系統(tǒng)地操縱基因表達(dá)強(qiáng)度，用于十二醇生物生產(chǎn)。通過(guò)測(cè)試來(lái)自大腸桿菌 MG1655 的 60 株工程菌株，實(shí)施了兩個(gè)連續(xù)的 DBTL 循環(huán)以增強(qiáng)葡萄糖的產(chǎn)物形成。在第一次迭代中，通過(guò)采用一組預(yù)測(cè)強(qiáng)度不同的 RBS 來(lái)調(diào)節(jié)不同�；� 載體蛋白（ACPs）/�；o酶 A（CoA）還原酶基因的表達(dá)。硫酯酶和�；o酶 A 合成酶基因同樣被納入這些設(shè)計(jì)中。接下來(lái)，將這些實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)濃度和產(chǎn)品產(chǎn)量數(shù)據(jù)輸入機(jī)器學(xué)習(xí)算法，以預(yù)測(cè)進(jìn)一步的優(yōu)化步驟�；谟�(jì)算機(jī)預(yù)測(cè) 的第二次迭代使十二醇滴度（0.83±0.13 g/l）比第一次循環(huán)的基礎(chǔ)菌株提高了21%。重要的是，Opgenorth 及其同事的研究在實(shí)現(xiàn)機(jī)器學(xué)習(xí)算法提出的設(shè)計(jì)時(shí)暴露了缺點(diǎn)。挑戰(zhàn)包括（i）可用RBS對(duì)蛋白質(zhì)含量的可預(yù)測(cè)性有限，（ii）途徑 蛋白的非靶向效應(yīng)（例如 FadD �；�-輔酶 A 合成酶的表觀毒性），（iii）通過(guò)改變 單個(gè) RBS（例如極性）帶來(lái)的整體操縱子效應(yīng)，（iv）當(dāng)使用密切相關(guān)（與完全 組合相反）構(gòu)造的訓(xùn)練集時(shí)，掩蓋整個(gè)數(shù)據(jù)空間中的局部趨勢(shì)，以及（iv）需要大數(shù)據(jù)集來(lái)可靠地訓(xùn)練機(jī)器學(xué)習(xí)路徑。
最近的另一項(xiàng)研究描述了一種半自動(dòng)管道，用于優(yōu)化釀酒酵母工程菌株生產(chǎn)白樺酸（一種五環(huán)三萜）。作者應(yīng)用了 SCRaMbLE，這是一種體內(nèi)誘導(dǎo)的合成染色體缺失系統(tǒng)，目的是生成多樣化的菌株庫(kù)。白樺酸途徑模塊的設(shè)計(jì)和構(gòu)建階段 是手動(dòng)進(jìn)行的，而測(cè)試部分是通過(guò)實(shí)施自動(dòng)化高通量篩選方法來(lái)執(zhí)行的。因此， 該文描述了使用酵母細(xì)胞工廠的全自動(dòng)化生物生產(chǎn)過(guò)程的最接近的例子之一，有可能包含實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化的額外步驟。另一種真菌物種假土曲霉（Aspergillus pseudoterus）已進(jìn)行了深入的、多組學(xué)指導(dǎo)的工程，用于聚合物前體 3-羥基丙酸 （3-HPA）的糖依賴性生物合成——在生物反應(yīng)器培養(yǎng)物中，滴度可達(dá) 0.88±0.11 g/l。該方法基于蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)，鑒定能夠從預(yù)期的 3-HPA 合成途徑排出通量的上調(diào)蛋白。建立了合成β-丙氨酸依賴的產(chǎn)物形成途徑，并通過(guò)刪除負(fù)責(zé) 3-HPA 降解的丙二酸半醛脫氫酶基因（Apald6）重新定向乙酰輔酶 A 通量。
這個(gè)章節(jié)的討論提供了自動(dòng)化潛力的原理示例。這些開(kāi)創(chuàng)性的研究還揭示了一個(gè)事實(shí)，即大體上，模式生物是首選的生物鑄造宿主。只有將細(xì)菌宿主的種類(lèi)大大擴(kuò)展到大腸桿菌之外，特別是生產(chǎn)非普通化學(xué)品，生物鑄造廠的全部潛力才能實(shí)現(xiàn)。這項(xiàng)工作需要一個(gè)自動(dòng)化的管道來(lái)實(shí)現(xiàn)非模型生物的合成工具集，同時(shí)需要組學(xué)驅(qū)動(dòng)的對(duì)其代謝和生理學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)的擴(kuò)展。下一節(jié)將討論生物鑄造廠如何成為這方面的關(guān)鍵參與者。
05
通過(guò)自動(dòng)化和擴(kuò)展合成生物學(xué)工具箱為基于非傳統(tǒng)宿主的細(xì)胞工廠鋪平道路
體內(nèi) DNA 模塊的構(gòu)建和組裝以及從頭途徑設(shè)計(jì)是細(xì)胞工廠開(kāi)發(fā)的重要組成部分。將這些技術(shù)推廣到非傳統(tǒng)宿主可以標(biāo)志著從緩慢馴化到合理設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)變， 克服復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)和有限的微生物生理學(xué)知識(shí)帶來(lái)的障礙。由于物種間的功能不相容性（例如，RecA 介導(dǎo)的重組較差），為生物技術(shù)主流的基因工程建立的方法很難轉(zhuǎn)移到非模型宿主。最近為非模式生物量身定制了一些尖端技術(shù)，但仍有很大的改進(jìn)空間——尤其是在準(zhǔn)確表征這些替代宿主中的工具方面。將非傳統(tǒng)微生物整合到生物鑄造管道中，不僅可以開(kāi)發(fā)出新的（潛在的，更高級(jí)的）細(xì)胞工廠， 而且還將刺激對(duì)這些宿主的基礎(chǔ)研究。生物鑄造廠可以生產(chǎn)大量的表型和組學(xué)數(shù)據(jù)，如果這些數(shù)據(jù)被廣泛提供給科學(xué)界，將成為學(xué)術(shù)界和工業(yè)界研究的指導(dǎo)資源。對(duì)新分離的微生物及其工具箱進(jìn)行表征，這項(xiàng)過(guò)去需要幾十年的努力，現(xiàn)在可以簡(jiǎn)化并以很小的時(shí)間和成本進(jìn)行。稍后將討論假單胞菌的基因組工程，以說(shuō)明生物鑄造廠在實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)方面可能發(fā)揮的作用。
工具箱優(yōu)化和大規(guī)模復(fù)用是 DBTL 周期構(gòu)建階段的兩個(gè)重要方面，以釋放非傳統(tǒng)主機(jī)作為單元工廠的潛力。假單胞菌基因組工程已經(jīng)針對(duì)手動(dòng)工作流程進(jìn) 行了優(yōu)化，但它可以進(jìn)一步發(fā)展為自動(dòng)化設(shè)置。到目前為止，最快的惡臭假單胞菌基因缺失方案需要將自殺質(zhì)粒共整合到感興趣的位點(diǎn)中。整合位點(diǎn)和要切除的區(qū)域由自殺質(zhì)粒中兩個(gè)同源臂（HA）的序列決定；用戶可以自由選擇這些臂來(lái)介導(dǎo)細(xì)菌染色體中幾乎任何位置的同源重組（HR）事件。通過(guò)在 HA 中加入遺傳元素，這些特征同樣可以整合到目標(biāo)基因座中。通過(guò)從輔助質(zhì)粒表達(dá)基因而反 式提供的 I-SceI 歸巢巨核酸酶引入雙鏈 DNA 斷裂，從而迫使第二個(gè) HR 事件從基因組中移除質(zhì)粒骨架和靶區(qū)。通過(guò)將質(zhì)粒復(fù)制的合成控制納入所謂的 pQURE 質(zhì)粒工具集，這一策略得到了升級(jí)，通過(guò)向培養(yǎng)基中添加 3-甲基苯甲酸鹽，可以 嚴(yán)格控制質(zhì)粒的繁殖。然而，這些方法的潛力有待充分挖掘。例如，自動(dòng)化可以用于在幾輪迭代中生成大型構(gòu)造庫(kù)。為此，可以采用克隆標(biāo)準(zhǔn)，例如標(biāo)準(zhǔn)歐洲向量架構(gòu)（SEVA），以模塊化方式組裝復(fù)雜回路，從而產(chǎn)生與許多革蘭氏陰性宿主兼容的廣泛宿主范圍構(gòu)建體，同時(shí)促進(jìn)遺傳部分的可重用性。在這里，作者提出了一個(gè)通過(guò)自動(dòng)化和并行化相結(jié)合的非傳統(tǒng)革蘭氏陰性菌快速基因組工程的原型工作流（圖1B）。該工作流程包括（i）遵循標(biāo)準(zhǔn)的模塊化 DNA 部分的平行和自動(dòng)組裝、（ii）用組裝的構(gòu)建體對(duì)大腸桿菌進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，（iii）高通量純化質(zhì)粒 DNA 并用質(zhì)粒文庫(kù)轉(zhuǎn)化所需宿主，隨后（iv）用自固化 pQURE 載體轉(zhuǎn)化并對(duì)所得無(wú)質(zhì)粒菌株變體進(jìn)行基因分型。該工作流程中的所有步驟都可以通過(guò)集成在機(jī)器人平臺(tái)中的自動(dòng)液體處理器輕松控制。
雖然已知該工作流程中提到的所有技術(shù)都可單獨(dú)應(yīng)用于 P.putida，但需要對(duì)其他宿主中的功能元件和部件（例如抗生素標(biāo)記、基因表達(dá)系統(tǒng)、HR 機(jī)制和效率、轉(zhuǎn)化方案和反選擇標(biāo)記）進(jìn)行快速和自動(dòng)原型設(shè)計(jì)，以驗(yàn)證其性能�？墒褂脧V泛使用的技術(shù)（例如，USER 克隆、Golden Gate 克隆、Gibson 組裝或 SureVector） 組裝此類(lèi)管道中使用的質(zhì)粒，并且根據(jù)所選擇的方法，自動(dòng)化協(xié)議最近已經(jīng)可用。按照標(biāo)準(zhǔn)化的克隆策略，一旦創(chuàng)建了大多數(shù)部分，就可以重新用于多種構(gòu)建體——例如質(zhì)粒主干。鑒于整合質(zhì)粒中作為 HA 所需的特定 PCR 擴(kuò)增子大小相等（約 500 bp），而不考慮靶點(diǎn)，這些 HA 可以以高通量方式獲得，例如 96 孔板（圖 1B 中的步驟 1）。對(duì)于許多克隆策略，DNA 片段的組裝可以在相同的布局中進(jìn)行， 甚至無(wú)需事先純化。一旦質(zhì)粒組裝好，它們就以 96 孔電穿孔板形式轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行繁殖（圖 1B 中的步驟 2）。通過(guò)克隆 PCR 和 Sanger 測(cè)序驗(yàn)證質(zhì)粒的正確 性。再次，使用標(biāo)準(zhǔn)化引物集進(jìn)行驗(yàn)證，這樣這一步驟也可以自動(dòng)化。由于 Sanger 測(cè)序價(jià)格合理，克隆效率通常很高，這種方法既具有經(jīng)濟(jì)競(jìng)爭(zhēng)力，又快速，因?yàn)椴恍枰?DNA 純化或凝膠電泳，從而實(shí)現(xiàn)高通量。圖1B 中的步驟 3 說(shuō)明了使用 市售 DNA 提取試劑盒以 96 孔板形式純化質(zhì)粒。然后通過(guò)電穿孔、化學(xué)轉(zhuǎn)化或綴合將純化的質(zhì)粒引入感興趣的（非傳統(tǒng)）宿主中，回收后，將細(xì)胞接種到選擇性培養(yǎng)基上以選擇亞倍體。請(qǐng)注意，將細(xì)菌懸浮液分散到選擇性瓊脂平板上以分離單個(gè)菌落是序列中的關(guān)鍵步驟，但基本上沒(méi)有實(shí)現(xiàn)這一目的的全自動(dòng)化、高效的方案。該方案的最后一部分（圖 1B 中的步驟 4）涉及通過(guò)在亞二倍體克隆中引入 pQURE 系統(tǒng)來(lái)強(qiáng)制第二次HR事件，然后進(jìn)行質(zhì)粒固化�？梢允褂藐幮赃x擇標(biāo)記（例如，sacB）來(lái)促進(jìn)質(zhì)粒消除，從而實(shí)現(xiàn)更高的產(chǎn)量。序列的最后一步是通過(guò)克隆 PCR 和 Sanger 測(cè)序進(jìn)行基因型確認(rèn)，如質(zhì)粒構(gòu)建階段所示。此時(shí)， 菌株庫(kù)已準(zhǔn)備好進(jìn)入測(cè)試階段，即多組學(xué)方法促進(jìn)的代謝網(wǎng)絡(luò)分析。
06
引入以代謝為中心的分析作為發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，指導(dǎo) DBTL 循環(huán)中的工程工作
采用非模式生物作為底盤(pán)的主要挑戰(zhàn)不僅是基因工程工具的相對(duì)缺乏—— 這可以通過(guò)實(shí)施上一節(jié)中建議的管道部分解決——而且關(guān)于代謝結(jié)構(gòu)及其調(diào)控的信息有限。因此，需要對(duì)不同環(huán)境條件下的代謝進(jìn)行詳細(xì)分析，例如遺傳或化學(xué)干擾，以了解代謝結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)。反過(guò)來(lái)，這些信息可以用于確定與生物技術(shù)相關(guān)的可行代謝景觀。與自動(dòng)化和合成生物學(xué)協(xié)同提高細(xì)胞工廠建設(shè)的速度和產(chǎn)量一樣，自動(dòng)化與多組學(xué)分析相結(jié)合可以擴(kuò)展對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)的知識(shí)。在計(jì)算數(shù)據(jù)集成的支持下，用于系統(tǒng)生物學(xué)目的的多組學(xué)已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，這允許全面理解跨多組學(xué)層的代謝網(wǎng)絡(luò)。多種檢測(cè)和測(cè)量技術(shù)可用于捕獲基因型-表型之間的信息，包括 DNA 和 RNA 測(cè)序（即基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)）、基于質(zhì)譜（MS）的代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和通量組學(xué)以及核磁共振。圖 2 以加速基因組工程、多組學(xué)分析和自動(dòng)化相結(jié)合的中心思想為基礎(chǔ)，為 DBTL 循環(huán)提供支持，同時(shí)解決微生物代謝的基本問(wèn)題。
這種類(lèi)型的多組學(xué)分析體現(xiàn)在代謝中心觀點(diǎn)在不同微生物中的一些應(yīng)用中。不足為奇的是，其中兩個(gè)例子中采用了一種因其多功能和復(fù)雜的代謝而被廣泛認(rèn)可的非傳統(tǒng)宿主——P.putida。該文討論的實(shí)例包含了對(duì)（i）δ-戊內(nèi)酰胺（哌啶 -2-酮）作為唯一碳源的利用和ε-己內(nèi)酰胺（氮雜環(huán)己內(nèi)酰胺）的分解代謝，以 及（ii）復(fù)雜的脂肪酸和酒精代謝的多組學(xué)探索。在第一個(gè)例子中，作者通過(guò)使用隨機(jī)條形碼轉(zhuǎn)座子測(cè)序（RB-TnSeq）和鳥(niǎo)槍蛋白質(zhì)組學(xué)的組合來(lái)研究δ-戊內(nèi)酰胺分解代謝，以提高內(nèi)酰胺滴度。一個(gè)特定位點(diǎn)（oplBA）被鑒定為編碼負(fù)責(zé)啟動(dòng)δ-戊內(nèi)酰胺分解的功能。接下來(lái)，刪除 oplBA 基因以防止δ-戊內(nèi)酰胺在富培養(yǎng)基中降解，這也減少了ε-己內(nèi)酰胺的消耗。然后，使用關(guān)鍵代謝前體（即 L-賴氨酸或5-氨基戊酸）的途徑也被刪除，使得δ-戊內(nèi)酰胺滴度從檢測(cè)不到的顯著增加到約 90 mg/L。在第二個(gè)例子中，RB-TnSeq 技術(shù)被用于為參與脂肪酸和酒精分解代謝的酶分配功能迄今其作用原理未知。通過(guò)序列同源性將功能分配給孤兒酶可能極具挑戰(zhàn)性，因?yàn)樵S多假定的旁系基因編碼相似的活性，可以共存，同時(shí)顯示不同的調(diào)控模式。在這種情況下，在對(duì)不同脂肪酸和醇作為唯一碳源的轉(zhuǎn)座子文庫(kù)進(jìn)行深度適應(yīng)度分析后，強(qiáng)表型可追溯到數(shù)百個(gè)基因。根據(jù)在不同鏈長(zhǎng)的脂肪酸上培養(yǎng)突變體池的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)推斷酶底物偏好。一個(gè)特定的蛋白質(zhì)家族，稱(chēng)為 DUF1302/DUF1329，被假設(shè)起酯酶的作用。此外，還發(fā)現(xiàn)了異戊醇（3-甲基丁烯-3-烯-1-醇，一種半萜醇）和異戊醇（3-乙基丁-1-醇）分解代謝的新途徑。這些醇被提議在初始氧化步驟和通過(guò) CoA 連接活化后通過(guò) L-亮氨酸代謝分解。由于脂肪酸和醇都是生產(chǎn)重要生物產(chǎn)品的關(guān)鍵前體，這項(xiàng)研究的結(jié)果必將指導(dǎo)未來(lái)的菌株設(shè)計(jì)。
細(xì)胞工廠構(gòu)建過(guò)程中的代謝中心觀點(diǎn)也體現(xiàn)在腔色鏈球菌產(chǎn)生聚酮抗生素放線素的過(guò)程中。在這里，基于代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的分析表明，環(huán)腺苷酸 （cAMP）濃度與放線素生物合成密切相關(guān)，這似乎是一種調(diào)節(jié)性、多效性效應(yīng)， 而不是直接的前體喂養(yǎng)。這一初步跡象導(dǎo)致作者在培養(yǎng)基中補(bǔ)充 cAMP。隨后的多組學(xué)分析表明，補(bǔ)充 cAMP 后，鳥(niǎo)嘌呤濃度增加。通過(guò)使用胍類(lèi)似物7-甲基鳥(niǎo) 嘌呤抑制了胍依賴性反應(yīng)，這排除了 cAMP 的積極作用，表明同源反應(yīng)介導(dǎo)了細(xì)菌生長(zhǎng)和抗生素生產(chǎn)的積極作用。
最后，通過(guò)自動(dòng)化將細(xì)胞工廠建設(shè)推向下一個(gè)水平的以代謝為中心的方法可 以依賴于將細(xì)菌生長(zhǎng)與感興趣分子的生物合成耦合，或?qū)⒆罱K促進(jìn)生物質(zhì)形成的多個(gè)代謝模塊耦合。攜帶生長(zhǎng)耦合模塊的菌株可以通過(guò)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化（ALE）進(jìn)化，以改進(jìn)表型豐富種群。這種方法將顯著減少篩選時(shí)間，因?yàn)樽R(shí)別高產(chǎn)量變體的參數(shù)是細(xì)菌生長(zhǎng)。這種策略在構(gòu)建細(xì)胞工廠以生物合成難以生產(chǎn)的化合物時(shí)尤其有用，例如鹵化分子，這些化合物需要大量的分析工作來(lái)檢測(cè)和定量。
07
觀點(diǎn)總結(jié)和未來(lái)方向
生物鑄造廠是在生物工業(yè)的框架內(nèi)出現(xiàn)的，以加速細(xì)胞工廠的發(fā)展。優(yōu)化工作流程，為可持續(xù)化工生產(chǎn)建立高性能、工業(yè)級(jí)微生物平臺(tái)，是現(xiàn)有生物鑄造廠的座右銘，無(wú)論是在工業(yè)界還是學(xué)術(shù)界。然而，利用生物鑄造廠的生產(chǎn)能力和概念框架 來(lái)獲得微生物生理學(xué)和代謝的基本知識(shí)，進(jìn)而將這些信息反饋到工作流程中，以支持細(xì)胞工廠設(shè)計(jì)，這一潛力尚未得到開(kāi)發(fā)。同樣，重新編程也為進(jìn)一步深入了解生命系統(tǒng)的復(fù)雜性提供了基礎(chǔ)性的見(jiàn)解，為后續(xù)的工程設(shè)計(jì)提供了動(dòng)力。這一概念將有助于為生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)重新編程細(xì)胞建立通用（而非生物特定）生物設(shè)計(jì)規(guī)則。
自動(dòng)化是這些發(fā)展的關(guān)鍵，但并非沒(méi)有挑戰(zhàn)。為了使整個(gè)實(shí)驗(yàn)室工作流程自動(dòng)化，管道中實(shí)施的協(xié)議必須一致，提供精確的量化并確保再現(xiàn)性。盡管支持技術(shù)越來(lái)越可靠，但仍有很大的改進(jìn)空間，因?yàn)樵谙到y(tǒng)或多或少獨(dú)立運(yùn)行之前，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化例程仍然需要耗時(shí)的優(yōu)化。與這些努力相結(jié)合，多元組學(xué)分析也帶來(lái)了一些障礙。很明顯，過(guò)去的學(xué)習(xí)在目標(biāo)分子和微生物宿主之間并沒(méi)有很好地傳遞， 而且實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)集的質(zhì)量、數(shù)量和一致性往往不足，無(wú)法從中學(xué)習(xí)，即使是大腸桿菌或酵母。因此，數(shù)據(jù)管理至關(guān)重要，因?yàn)樯疃群透咄糠治鰰?huì)產(chǎn)生大量數(shù)據(jù)集。由于這些不一致性，多組分?jǐn)?shù)據(jù)集成相當(dāng)具有挑戰(zhàn)性，在開(kāi)放獲取環(huán)境中跨生物鑄造廠的數(shù)據(jù)比較將至關(guān)重要。幸運(yùn)的是，已經(jīng)建立了一些計(jì)算工具以及統(tǒng)計(jì)工具箱來(lái)支持這些發(fā)展。如上述的一些示例所示，由于機(jī)器學(xué)習(xí)的預(yù)測(cè)能力，它也成為合成生物學(xué)的堅(jiān)實(shí)支柱。
作者認(rèn)為，為該文所述目的調(diào)整生物鑄造廠可以以相對(duì)簡(jiǎn)單的方式完成。在持續(xù)的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒 2（SARS-CoV-2）大流行期間，生物鑄造廠的多功能性已成為一個(gè)明顯的例子，因?yàn)樾l(wèi)生危機(jī)暴露了創(chuàng)新和快速適應(yīng)的生物技術(shù)方法對(duì)抵消其影響的重要性。迅速調(diào)整現(xiàn)有科學(xué)基礎(chǔ)設(shè)施和勞動(dòng)力的用途， 從而開(kāi)發(fā)出安全有效的候選疫苗。按照同樣的推理，可以預(yù)期，重新啟動(dòng)生物鑄造廠以支持基本發(fā)現(xiàn)將擴(kuò)大對(duì)非傳統(tǒng)微生物固有代謝復(fù)雜性的現(xiàn)有理解。因此， 在 DBTL循環(huán)中應(yīng)用以代謝為中心的層將在未來(lái)通過(guò)生物合成途徑獲得化學(xué)物質(zhì)來(lái)升級(jí)工業(yè)生物技術(shù)，而到目前為止，這些化學(xué)物質(zhì)已超出常用細(xì)胞工廠的生物學(xué)范圍。盡管仍有一些挑戰(zhàn)有待解決（見(jiàn)未決問(wèn)題），但該文中提出的一些解決方案可能有助于在急需替代石油生產(chǎn)（受到各種政治和經(jīng)濟(jì)影響）的時(shí)候鞏固生物經(jīng)濟(jì)。
08
未解決的問(wèn)題
非傳統(tǒng)宿主中復(fù)雜（和有利）細(xì)胞性狀的生化和遺傳基礎(chǔ)是什么？
合成生物學(xué)能否實(shí)現(xiàn)這些特性的正向工程？
生物鑄造廠會(huì)根據(jù)預(yù)期應(yīng)用以及大量的底盤(pán)集來(lái)選擇最合適的宿主嗎？
自動(dòng)化是否可以通過(guò)便利通常耗時(shí)的協(xié)議來(lái)推動(dòng)處理代謝工程的方式的革命？
這些以代謝為中心的自動(dòng)化序列在多大程度上有助于在實(shí)際工業(yè)規(guī)模上部署非傳統(tǒng)細(xì)胞工廠？
全文完
參考文獻(xiàn)：Gurdo N, Volke DC, Nikel PI. Merging automation and fundamental discovery into the design-build-test-learn cycle of nontraditional microbes. Trends in Biotechnology. 2022;40(10):1148-59.
Mediacenter Editor | 曼森編輯
文章來(lái)源：本文由中科院上海生命科學(xué)信息中心與曼森生物合作供稿
排版校對(duì)：劉娟娟編輯
內(nèi)容審核：郝玉有博士
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