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使用ReacSight增強(qiáng)生物反應(yīng)器陣列以實現(xiàn)自動測量和反應(yīng)控制

瀏覽次數(shù)：1152　發(fā)布日期：2023-1-30　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

跟蹤智慧實驗室的理論研究發(fā)展?fàn)顩r、產(chǎn)業(yè)發(fā)展動態(tài)、主要設(shè)備供應(yīng)商產(chǎn)品研發(fā)動態(tài)、國內(nèi)外智慧實驗室建設(shè)成果現(xiàn)狀等信息內(nèi)容。本文由中科院上海生命科學(xué)信息中心與曼森生物合作供稿。

本期推文，編譯了 François Bertaux 等發(fā) 表在 Nature Communications 期刊上的研究論文《使用 ReacSight 增強(qiáng)生物反應(yīng)器陣列以實現(xiàn)自動測量和反應(yīng)控制》（Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight），介紹了 ReacSight，一種用于自動測量和反應(yīng)實驗控制的增強(qiáng)生物反應(yīng)器陣列的策略。ReacSight 利用低成本移液機(jī)器人進(jìn)行樣品采集、處理和裝載，并提供靈活的儀器控制架構(gòu)。作者展示了 ReacSight 在涉及酵母的三種實驗應(yīng)用中的能力，包括：基因表達(dá)的實時光遺傳控制；營養(yǎng)缺乏對健康和細(xì)胞應(yīng)激的影響；對雙菌株混合群落的組成進(jìn)行動態(tài)控制。

目錄
/CONTENT
01/引言
02/結(jié)果
2.1 測量自動化、平臺軟件集成和 ReacSight 的反應(yīng)性實驗控制
2.2 反應(yīng)性光遺傳控制和酵母連續(xù)培養(yǎng)的單細(xì)胞解析特性
2.3 使用光實時控制基因表達(dá)
2.4 探索營養(yǎng)缺乏對健康和細(xì)胞壓力的影響
2.5 ReacSight 是一種通用策略：通過吸液功能增強(qiáng)平板閱讀器
03/討論

01
引言
小規(guī)模、低成本的生物反應(yīng)器正在成為微生物系統(tǒng)和合成生物學(xué)研究的有力工具。它們允許在長時間（幾天）內(nèi)嚴(yán)格控制細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)（例如溫度、細(xì)胞密度、培養(yǎng)基更新率）。這些獨特的特點使研究人員能夠進(jìn)行復(fù)雜的實驗,并實現(xiàn)實驗的高度再現(xiàn)性。例如，當(dāng)藥物選擇壓力隨著耐藥性的發(fā)展而增加時，抗生素耐藥性的表征，細(xì)胞間通信合成路徑的細(xì)胞密度控制表征，以及使用組合敲除文庫在動態(tài)變化溫度下酵母適應(yīng)度的全基因組表征。

原位光密度測量只能提供總生物量濃度及其增長率的信息，而熒光測量的靈敏度低，背景高。通常還必須測量和跟蹤培養(yǎng)細(xì)胞群體的關(guān)鍵特征，如基因表達(dá)水平、細(xì)胞應(yīng)激水平、細(xì)胞大小和形態(tài)、細(xì)胞周期進(jìn)程、不同基因型或表型的比例。研究人員通常需要手動提取、處理和測量培養(yǎng)樣本，以便通過更靈敏和專業(yè)的儀器（如細(xì)胞儀、顯微鏡、測序儀）進(jìn)行檢測。手動干預(yù)通常繁瑣、容易出錯，并嚴(yán)重限制了可用的時間分辨率和范圍（即夜間無時間點）。

它還阻礙了培養(yǎng)條件對此類措施的動態(tài)適應(yīng)。這種反應(yīng)性實驗控制目前正引起系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)的興趣。它既可以用來維持種群的某種狀態(tài)（外部反饋控制），也可以用來最大化實驗的價值（反應(yīng)性實驗設(shè)計）。例如，外部反饋控制可用于解開復(fù)雜的細(xì)胞耦合和信號通路調(diào)控，控制微生物群落的組成，或優(yōu)化工業(yè)生物生產(chǎn)。反應(yīng)性實驗設(shè)計在長時間不確定實驗（如人工進(jìn)化實驗）的背景下特別有用。通過實現(xiàn)實時參數(shù)推斷和優(yōu)化實驗設(shè)計，也有助于加速基于模型的生物系統(tǒng)表征。

原則上，商業(yè)機(jī)器人設(shè)備和/或定制硬件可用于將生物反應(yīng)器陣列連接到敏感的多樣本（通常接受 96 孔板作為輸入）測量設(shè)備。然而，這對設(shè)備采購、設(shè)備成本和軟件集成提出了巨大挑戰(zhàn)。當(dāng)一個功能平臺建立起來時，相應(yīng)硬件和軟件的升級和維護(hù)也極具挑戰(zhàn)性。因此，迄今為止報告的例子很少。例如，只有兩個小組展示了細(xì)菌或酵母培養(yǎng)物的自動細(xì)胞術(shù)和反應(yīng)性光遺傳學(xué)控制，設(shè)置僅限于單個連續(xù)培養(yǎng)物或具有有限連續(xù)培養(yǎng)能力的多個培養(yǎng)物。一組還展示了自動顯微鏡和反應(yīng)性光遺傳學(xué)控制單個酵母連續(xù)培養(yǎng)。

ReacSight，一種通用且靈活的策略，用于增強(qiáng)生物反應(yīng)器陣列的自動化測量和反應(yīng)實驗控制。ReacSight 非常適合集成開放源代碼、開放硬件組件，但也可以容納封閉源代碼、僅限 GUI 的組件（如細(xì)胞儀）。首先，作者使用 ReacSight 組裝一個平臺，實現(xiàn)基于細(xì)胞術(shù)的特征描述和平行酵母連續(xù)培養(yǎng)的反應(yīng)性光遺傳學(xué)控制。重要的是，作者構(gòu)建了兩個版本的平臺，要么使用定制的生物反應(yīng)器陣列，要么使用最新的低成本、開放硬件、商業(yè)化的光遺傳學(xué) Chi.生物反應(yīng)器。

然后，作者在三個案例研究中證明了它的有用性。首先，作者在不同的生物反應(yīng)器中用光實現(xiàn)基因表達(dá)的并行實時控制。第二，作者利用高度受控和信息豐富的競爭分析，探討營養(yǎng)缺乏對健康和細(xì)胞應(yīng)激的影響。第三，作者利用平臺的養(yǎng)分稀缺性和反應(yīng)性實驗控制能力，實現(xiàn)對兩個菌株混合群落的動態(tài)控制。最后，為了進(jìn)一步證明 ReacSight 的通用性，作者使用它來增強(qiáng)具有吸液能力的平板閱讀器，并對大腸桿菌臨床分離物進(jìn)行復(fù)雜的抗生素處理。

02
結(jié)果

2.1 測量自動化、平臺軟件集成和 ReacSight 的反應(yīng)性實驗控制
ReacSight 戰(zhàn)略旨在增強(qiáng)用于自動測量和反應(yīng)實驗控制的生物反應(yīng)器陣列，以靈活和標(biāo)準(zhǔn)化的方式將硬件和軟件元素結(jié)合起來（圖 1）。吸管機(jī)器人用于以通用方式在任何生物反應(yīng)器陣列和任何基于平板的測量設(shè)備之間建立物理連接（圖 1a）。生物反應(yīng)器培養(yǎng)物樣本通過連接在機(jī)械臂上的泵控取樣管線發(fā)送至移液機(jī)器人（取樣）。使用移液機(jī)器人的一個主要優(yōu)點是，在測量（處理）之前，可以在培養(yǎng)樣本上自動執(zhí)行不同的處理步驟。然后，樣品由移液機(jī)器人轉(zhuǎn)移至測量裝置（裝載）。當(dāng)然，這需要測量設(shè)備的物理定位，以便當(dāng)其裝載托盤打開時，機(jī)器人手臂可以接近設(shè)備輸入板的孔。部分接近設(shè)備輸入板通常不是問題，因為機(jī)器人可用于在測量之間清洗輸入板孔，允許隨著時間的推移重復(fù)使用相同的孔（清洗）。重要的是，如果不需要反應(yīng)性實驗控制，或者如果不是基于測量，機(jī)器人功能也可以用于處理和存儲培養(yǎng)樣本，以便在實驗結(jié)束時進(jìn)行一次性離線測量，從而實現(xiàn)具有靈活時間分辨率和范圍的自動測量。

ReacSight 還提供了一些軟件挑戰(zhàn)的解決方案，這些軟件挑戰(zhàn)應(yīng)該解決，以解鎖多生物反應(yīng)器的自動測量和反應(yīng)實驗控制（圖 1b）。首先，需要對平臺的所有儀器（生物反應(yīng)器、移液機(jī)器人、測量設(shè)備）進(jìn)行程序控制。其次，一臺計算機(jī)應(yīng)該與所有儀器進(jìn)行通信，以協(xié)調(diào)整個實驗。ReacSight 將 Python 編程語言的多功能性和強(qiáng)大功能與 Flask web 應(yīng)用程序框架的通用性和可伸縮性相結(jié)合，以應(yīng)對這兩個挑戰(zhàn)。事實上，Python 非常適合輕松構(gòu)建 API 來控制各種儀器：有完善的開源庫用于控制微控制器（如 Arduinos），甚至用于基于“點擊”的控制 GUI 專用軟件驅(qū)動缺少 API 的封閉源代碼儀器（pyautogui）。重要的是，開源、低成本的吸管機(jī)器人 OT-2（Opentrons）附帶了本地 Python API。Hamilton 機(jī)器人也可以通過 Python API 進(jìn)行控制。然后，F(xiàn)lask 可用于公開所有儀器 API，以便通過本地網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行簡單訪問。然后，從一臺計算機(jī)協(xié)調(diào)對多個儀器的控制的任務(wù)基本上簡化為發(fā)送 HTTP 請求的簡單任務(wù)，例如使用 Python 模塊請求。HTTP 請求還可以使用社區(qū)級數(shù)字分發(fā)平臺Discord 實現(xiàn)從實驗到遠(yuǎn)程用戶的用戶友好通信。

這種多功能儀表控制結(jié)構(gòu)是 ReacSight 的關(guān)鍵組件。ReacSight 的另外兩個關(guān)鍵組件是（1）通用的面向?qū)ο蟮氖录䦟崿F(xiàn)（如果發(fā)生這種情況，請這樣做），以促進(jìn)反應(yīng)性實驗控制；（2）將所有儀器操作詳盡記錄到單個日志文件中。ReacSight 軟件以及硬件的源文件在 ReacSight-Git 存儲庫中公開提供。

圖1 ReacSight：用于自動測量和反應(yīng)實驗控制的增強(qiáng)生物反應(yīng)器陣列的策略。a 在硬件方面，ReacSight 利用吸管機(jī)器人（如低成本、開源 Opentrons OT-2）在任何多生物反應(yīng)器設(shè)置（eVOLVER、Chi.Bio、custom……）和任何基于平板的測量設(shè)備（平板閱讀器、細(xì)胞儀、高通量顯微鏡、pH 計……）的輸入之間建立物理鏈接。如有必要，可使用移液機(jī)器人對生物反應(yīng)器樣本進(jìn)行處理（稀釋、固定、提取、純化……），然后再裝入測量裝置。如果不需要反應(yīng)實驗控制，處理過的樣品也可以存儲在機(jī)器人平臺上進(jìn)行離線測量（OT-2 溫度模塊可以幫助保存對溫度敏感的樣品）。b 在軟件方面，ReacSight 通過基于Python 和PythonWeb 應(yīng)用程序框架 Flask 的多功能儀器控制體系結(jié)構(gòu)實現(xiàn)了全平臺集成。ReacSight 軟件還提供了一個通用事件系統(tǒng)，以實現(xiàn)反應(yīng)性實驗控制。顯示了反應(yīng)實驗控制的簡單用例的示例代碼。實驗控制還可以使用Discord webhooks 將實驗狀態(tài)通知遠(yuǎn)程用戶，并生成詳盡的日志文件。

2.2 反應(yīng)性光遺傳控制和酵母連續(xù)培養(yǎng)的單細(xì)胞解析特性
作者首次應(yīng)用 ReacSight 策略的動機(jī)是酵母合成生物學(xué)應(yīng)用。在這種情況下，精確控制合成路徑并在定義明確的環(huán)境條件下測量其輸出，并具有足夠的時間分辨率和范圍是至關(guān)重要的。光遺傳學(xué)為控制合成路徑提供了一種極好的方法，生物反應(yīng)器支持的連續(xù)培養(yǎng)是對環(huán)境條件進(jìn)行長時間嚴(yán)格控制的理想方法。為了測量單個細(xì)胞的路徑輸出，細(xì)胞術(shù)提供了高靈敏度和高通量。因此，借助 ReacSight 策略，利用臺式細(xì)胞儀作為測量設(shè)備，組裝了一個完全自動化的實驗平臺，實現(xiàn)了對酵母連續(xù)培養(yǎng)物的反應(yīng)性光遺傳學(xué)控制和單細(xì)胞解析表征（圖 2a）。

補(bǔ)充說明 2 提供了平臺硬件和軟件的詳細(xì)信息，此處僅討論關(guān)鍵要素。八個反應(yīng)器與移液機(jī)器人相連，這意味著每個時間點都會填滿一列取樣板。雖然機(jī)器人可以接觸到三列細(xì)胞儀輸入板，但作者僅使用一列，由機(jī)器人進(jìn)行廣泛清洗，以實現(xiàn)小于 0.2%的殘留，使用免疫磁珠進(jìn)行驗證。通常在機(jī)器人平臺上安裝兩個傾翻箱和兩個取樣板（2×96=192 個樣本），因此，在沒有任何人為干預(yù)的情況下，八個反應(yīng)器中的每一個都有 24 個時間點。為了實現(xiàn)基于細(xì)胞數(shù)據(jù)的反應(yīng)性實驗控制，作者開發(fā)并實施了算法，以在重疊熒光團(tuán)之間執(zhí)行自動選通和光譜反褶積（圖 2b）。

作者首先通過對組成性表達(dá)來自染色體整合轉(zhuǎn)錄單位的各種熒光蛋白的酵母菌株進(jìn)行長期恒濁培養(yǎng)來驗證平臺的性能（圖 2c）。熒光團(tuán)水平的分布是單峰的，隨著時間的推移是穩(wěn)定的，正如在具有組成型啟動子的穩(wěn)定生長條件下所預(yù)期的那樣。mNeonGreen 和 mScarlet-I 在單色和三色菌株之間的分布完全重疊。這與從強(qiáng) pTDH3 啟動子表達(dá)一個或三個熒光蛋白對細(xì)胞生理學(xué)的影響可以忽略不計的假設(shè)是一致的，并且三色菌株中轉(zhuǎn)錄單位的相對位置（mCerulean 第一， mNeonGreen 第二，mCarlet-I）對基因表達(dá)的影響很小。與單色品系相比，三色品系中測得的 mCerulean 水平略高（~15%）。這可能是由于反褶積中的殘余誤差造成的，與自熒光和 mNeonGreen 相比，mCerulean 的亮度較低加劇了這種誤差。為了驗證平臺的光遺傳學(xué)能力，作者構(gòu)建了一個基于 EL222 系統(tǒng) 17 的光誘導(dǎo)基因表達(dá)路徑并對其進(jìn)行了表征（圖 2d）。正如預(yù)期的那樣，應(yīng)用不同的藍(lán)光開-關(guān)時間模式導(dǎo)致熒光團(tuán)水平的動態(tài)分布覆蓋范圍很廣，從接近零水平（即幾乎無法與自體熒光區(qū)分）到超過強(qiáng)組成啟動子 pTDH3 獲得的水平。高誘導(dǎo)表達(dá)水平的細(xì)胞間變異性也很低，變異系數(shù)（CV）值與 pTDH3 啟動子相當(dāng)（0.22 vs 0.20）。

作者組裝的第一個平臺使用了一個預(yù)先存在的定制光生生物反應(yīng)器陣列。這種設(shè)置有幾個優(yōu)點（可靠性、工作容量范圍廣），但其他實驗室無法輕易復(fù)制。由于 ReacSight 架構(gòu)的模塊化，可以通過將這個定制的生物反應(yīng)器陣列與最近描述的開放硬件、光遺傳學(xué)就緒的商用 Chi.生物反應(yīng)器（圖 2a（右圖））交換，快速構(gòu)建具有類似功能的平臺的第二個版本。為了驗證該平臺的另一版本的性能，作者使用圖 2d 中相同的菌株進(jìn)行了光誘導(dǎo)實驗，并獲得了各種光誘導(dǎo)曲線的極好的反應(yīng)器到反應(yīng)器再現(xiàn)性。

圖 2 基于 ReacSight 的自動化平臺組裝，實現(xiàn)對酵母連續(xù)培養(yǎng)物的反應(yīng)性光遺傳學(xué)控制和單細(xì)胞解析表征。a 平臺概述。Opentrons OT-2 移液機(jī)器人用于將支持光基因的多生物反應(yīng)器連接到臺式細(xì)胞儀（Guava EasyCyte 14HT，Luminex）。機(jī)器人用于稀釋細(xì)胞儀輸入板中的新鮮培養(yǎng)樣本，并在時間點之間清洗。“點擊”Python 庫 pyautogui 用于創(chuàng)建細(xì)胞儀儀器控制 API。定制算法是在 Python 中開發(fā)和實現(xiàn)的，用于實時自動選通和去卷積細(xì)胞數(shù)據(jù)。使用定制的生物反應(yīng)器裝置（左圖）或 Chi 生物反應(yīng)器（右圖）組裝了兩個版本的平臺。b 選通和反褶積算法說明。例如，顯示了重疊熒光團(tuán) mCerulean 和 mNeonGreen 之間的反褶積。c 多代單細(xì)胞基因表達(dá)分布的穩(wěn)定性。從 pTDH3 啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄單位中組成性表達(dá) mCerulean、 mNeonGreen 或 mCarlet-I 的菌株（“三色”菌株），整合到染色體中，在濁度調(diào)節(jié)器模式下生長（OD 設(shè)定值=0.5，上限圖），每小時采集一次細(xì)胞儀（垂直綠線）。所有時間點的熒光強(qiáng) 度分布（通過高斯核密度估計進(jìn)行平滑）（選通、反褶積和前向散射歸一化后，F(xiàn)SC）用不同的顏色陰影繪制在一起（下圖）。RPU：相對啟動子單位（見方法）。為了簡單起見，未顯示 “三色”的 OD 數(shù)據(jù)，與其他類似。d 基于 EL222 系統(tǒng)的光驅(qū)動基因表達(dá)電路的特性。應(yīng)用三種不同的開-關(guān)藍(lán)光時間剖面圖（底部），每 45 分鐘采集一次細(xì)胞儀。門控、去卷積、FSC 標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)的中位數(shù)如圖所示（頂部）。此圖中顯示的所有生物反應(yīng)器實驗均在同一天與定制生物反應(yīng)器平臺版本并行進(jìn)行。源數(shù)據(jù)作為源數(shù)據(jù)文件提供。

2.3 使用光實時控制基因表達(dá)
為了展示平臺的反應(yīng)性光遺傳控制能力，作者開始動態(tài)適應(yīng)光刺激，以便將熒光團(tuán)水平保持在不同的目標(biāo)設(shè)定點。這種用于體內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的電子反饋有助于在存在復(fù)雜細(xì)胞調(diào)控的情況下剖析內(nèi)源性路徑的功能，并有助于將合成系統(tǒng) 用于生物技術(shù)應(yīng)用。作者首先構(gòu)建并驗證了光誘導(dǎo)基因表達(dá)的簡單數(shù)學(xué)模型（圖 3a）。將三個模型參數(shù)與圖 2d 的表征數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合擬合，得到了良好的定量一致性�？紤]到模型假設(shè)的簡單性，這一點值得注意：光激活下的 mRNA 生成速率恒定，每 mRNA 的翻譯速率恒定，mRNA（大部分降解，半衰期為 20 分鐘）和蛋白質(zhì)（大部分稀釋，半衰率為 1.46 小時）的一級衰變。因此，當(dāng)實驗條件得到很好的控制并且數(shù)據(jù)得到適當(dāng)?shù)奶幚頃r，人們可以希望用一小套簡單的過程來定量地解釋生物系統(tǒng)的行為。然后，作者將擬合模型合并到模型預(yù)測控制算法中（圖 3b）。該算法與 ReacSight 事件系統(tǒng)一起，實現(xiàn)了對不同反應(yīng)器中不同目標(biāo)的熒光水平的精確實時控制（圖 3c）。為了進(jìn)一步證明平臺的穩(wěn)健性和再現(xiàn)性，作者在幾個月后進(jìn)行了另一個單 8 反應(yīng)器實驗，涉及兩個熒光團(tuán)目標(biāo)水平的四個重復(fù)反應(yīng)器運(yùn)行。所有的重復(fù)都能很好地跟蹤目標(biāo)，并且控制算法決定的光分布在相同目標(biāo)的重復(fù)之間非常相似，但并不完全相同。

作者還研究了之前使用的誘導(dǎo)系統(tǒng)在更長時間尺度上的遺傳穩(wěn)定性。遺傳穩(wěn) 定性是工業(yè)生物生產(chǎn)的一個重要因素。作者觀察到，EL222 驅(qū)動的 mNeonGreen 蛋白的誘導(dǎo)可以持續(xù) 5 天以上，并且具有很好的穩(wěn)定性（圖 3d 頂部）。更進(jìn)一步，作者測試了同一蛋白的分泌版本是否表現(xiàn)出類似的表達(dá)穩(wěn)定性。作者觀察到，誘導(dǎo)約2天后細(xì)胞水平顯著降低。細(xì)胞異質(zhì)性也增加了（圖3d右側(cè)）。為了彌補(bǔ)細(xì)胞水平的下降，作者將表達(dá)盒整合成多個拷貝（三次，串聯(lián)染色體插入）。誘導(dǎo)后，獲得了非常高的熒光水平（圖 3d 底部）。令人驚訝的是，這些水平比非分泌蛋白高一個數(shù)量級，并伴隨著強(qiáng)烈的應(yīng)激，正如未折疊蛋白應(yīng)激報告所反映的那樣（pUPR mScarletI）。誘導(dǎo)后，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水平逐漸下降。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水平顯示出明顯的雙峰分布，強(qiáng)烈的遺傳不穩(wěn)定性跡象（圖 3d 右側(cè)）。最后，當(dāng)以最大誘導(dǎo)水平的三分之一誘導(dǎo)時，相同的三重拷貝結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出非單調(diào)行為：高水平初始反應(yīng)，隨后細(xì)胞內(nèi)水平緩慢下降，如完全誘導(dǎo)的三重結(jié)構(gòu)，隨后長期內(nèi)部高蛋白水平的非預(yù)期緩慢恢復(fù)（圖 3d 底部）。這種恢復(fù)可以通過細(xì)胞適應(yīng)高生產(chǎn)需求來解釋，或者更可能的是，通過選擇高產(chǎn)亞群來解釋，該亞群能夠更好地保存 HIS3 選擇標(biāo)記，即使在完全培養(yǎng)基中也具有輕微的生長優(yōu)勢。這個實驗證明了作者的平臺能夠執(zhí)行長時間的實驗，并以相對較高的時間分辨率提供單小區(qū)信息。此外，它促使探索和利用營養(yǎng)素可用性對健康和壓力的影響。

圖 3 閉環(huán)：使用光實時控制基因表達(dá)。a 光驅(qū)動基因表達(dá)電路的簡單 ODE 模型擬合到圖 2d 的表征數(shù)據(jù)。擬合參數(shù)為γm=2.09 h−1，σ=0.64 RPU 小時−1，γFP=0.475 小時−1·km 被任意設(shè)置為等于γm，以僅允許從蛋白質(zhì)中值水平識別參數(shù)。b 實時控制基因表達(dá)的策略。每小時進(jìn)行一次細(xì)胞儀采集，在選通、反褶積和 FSC 歸一化后，數(shù)據(jù)被送入模型預(yù)測控制（MPC）算法。該算法使用該模型搜索 10 個周期為 30 分鐘的工作循環(huán)（即 5 小時的后退地平線）的最佳占空比序列，以跟蹤目標(biāo)水平。c 四種不同目標(biāo)水平的實時控制結(jié)果，在不同的生物反應(yīng)器中并行執(zhí)行（自定義設(shè)置）。左：單個單元格的中位數(shù)（控制值）。右：單細(xì)胞隨時間的分布。請注意，所有繪圖都使用線性比例。d 表達(dá)系統(tǒng)的長期穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)分泌的影響。表達(dá) EL222 驅(qū)動的 mNeonGreen 熒光報告子的細(xì)胞，無論是否分泌，在濁度調(diào)節(jié)器中生長 5 天，每 2 小時進(jìn)行一次細(xì)胞儀測量。表示整個實驗期間的平均表達(dá)水平。熒光分布也顯示在選定的時間點（誘導(dǎo)后 0、6、48 和 120 小時）。細(xì)胞也有分泌應(yīng)激的熒光報告子（pUPRmScarlet-I）。還提供了三個拷貝中整合的 mNeonGreen 報告蛋白的分泌形式的結(jié)果。相關(guān)蛋白（mNeonGreen 水平）和應(yīng)激水平（mCarlet-I 水平）分布的時間演變?nèi)缪a(bǔ)充圖 11 和 12 所示。源數(shù)據(jù)作為源數(shù)據(jù)文件提供。

2.4
探索營養(yǎng)缺乏對健康和細(xì)胞壓力的影響
熒光蛋白可以作為報告物來評估細(xì)胞的表型特征，也可以作為條形碼來標(biāo)記具有特定基因型的菌株。再加上生物反應(yīng)器陣列的自動細(xì)胞儀，這種能力擴(kuò)展了可能的實驗范圍：在動態(tài)控制環(huán)境中的多重菌株特性和競爭（圖 4a）。事實上，一些熒光蛋白可用于基因分型，其他可用于表型分型。然后，自動細(xì)胞儀（包括原始數(shù)據(jù)分析）將提供關(guān)于不同菌株之間競爭動態(tài)和每個菌株的細(xì)胞狀態(tài)分布動態(tài)的定量信息。根據(jù)實驗的目標(biāo)，這些豐富的信息可以反饋給實驗控制，以適應(yīng)每個反應(yīng)器的環(huán)境參數(shù)。

作為可以進(jìn)行此類實驗的概念的第一個證明，作者開始探索營養(yǎng)缺乏對健康和細(xì)胞壓力的影響（圖 4b，左上角）。微生物群落中的不同物種根據(jù)其代謝多樣性或?qū)I(yè)性有不同的營養(yǎng)需求，因此它們的適合性不僅取決于外部環(huán)境因素，還取決于群落本身通過營養(yǎng)物質(zhì)消耗、代謝物釋放和其他細(xì)胞間耦合。與分批競爭分析相反，連續(xù)培養(yǎng)允許控制這些因素。例如，在恒濁器培養(yǎng)基中，營養(yǎng)素的可用性取決于營養(yǎng)素供應(yīng)（即輸入介質(zhì)中的營養(yǎng)素水平）和細(xì)胞的營養(yǎng)素消耗（主要取決于 OD 設(shè)定值）。作者使用組氨酸營養(yǎng)不良作為營養(yǎng)缺乏的模型：對于 his3 突變細(xì)胞，組氨酸是一種必需的營養(yǎng)素。通過將 his3 突變細(xì)胞與野生型細(xì)胞在不同 OD 設(shè)定值和喂養(yǎng)介質(zhì)中不同組氨酸濃度下進(jìn)行競爭，可以測量營養(yǎng)缺乏如何影響適應(yīng)性（圖 4b，右上角）。在這兩個菌株中使用應(yīng)激報告子也可以了解營養(yǎng)缺乏情況下適應(yīng)性和細(xì)胞壓力之間的關(guān)系。作者將重點放在未折疊蛋白反應(yīng) （UPR）應(yīng)激上，以研究營養(yǎng)應(yīng)激是否會導(dǎo)致其他事先無關(guān)的應(yīng)激類型，這將表明細(xì)胞生理學(xué)中的全局耦合。

組氨酸濃度為 4µM 時，在考慮的 OD 設(shè)定值（0.1-0.8）范圍內(nèi)，his3 突變細(xì)胞被野生型細(xì)胞強(qiáng)烈競爭（圖 4b，左下角）。當(dāng)濃度為 20µM 時，情況不再如此。在這種濃度下，野生型細(xì)胞的生長速度優(yōu)勢在 OD 設(shè)定值 0.6 以下接近零（剩余組氨酸足以使 his3 突變細(xì)胞正常生長），在最大 OD 設(shè)定點 0.8 時超過 0.2 h −1（剩余組胺過低，限制了 his3 突變體細(xì)胞的生長）。因此，對于這種營養(yǎng)供應(yīng)水平，細(xì)胞的營養(yǎng)消耗水平對 his3 突變細(xì)胞的適應(yīng)性有很大影響。4µM 到 20µM 之間的這種定性變化與組氨酸的單個高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)體 HIP1 的 Km 常數(shù)報告值 17µM 高度一致。此外，因為組氨酸濃度為 4µM 的野生型和突變型細(xì)胞之間的生長速度差異接近甚至超過野生型細(xì)胞通常觀察到的生長速度（在 0.3 到 0.45 h −1之間，取決于 OD 設(shè)定值），作者得出結(jié)論，突變細(xì)胞在這些條件下完全生長。UPR 數(shù)據(jù)顯示，在組氨酸濃度為 20µM 的所有 OD 設(shè)定點上，突變細(xì)胞和野生型細(xì)胞之間幾乎沒有差異，但在組氨酸含量為 4µM 時，突變細(xì)胞中的 UPR 反應(yīng)明顯激活（圖 4b，右下角）。因此，看似相似的生長表型（例如 4 和 20µM OD 為 0.8 的突變細(xì)胞）可能對應(yīng)于不同的生理狀態(tài)（如不飽和蛋白反應(yīng)應(yīng)激水平的差異所揭示的）。

此外，為了展示基于菌株豐度數(shù)據(jù)的環(huán)境反應(yīng)控制，作者著手動態(tài)控制兩個菌株的比率�？刂莆⑸锱囵B(yǎng)物的組成和異質(zhì)性有望實現(xiàn)更有效的生物加工策略。作者推斷，當(dāng)兩種菌株中的一種對組氨酸具有營養(yǎng)缺陷時，培養(yǎng)物的 OD 可以用作方向盤。事實上，組氨酸生物合成突變生長速率在 20µM 的中等組氨酸濃度下對 OD 的強(qiáng)烈依賴性（圖 4b，左下角）意味著可以通過切換恒濁器培養(yǎng)物的 OD 設(shè)定值來動態(tài)控制其生長速率。此外，如果這種菌株與組氨酸原營養(yǎng)菌菌株共同培養(yǎng)，但以 OD 獨立的方式生長較慢，則可以實現(xiàn)兩種菌株比率的雙向控制（圖 4c，左）。作者利用繁重的異源蛋白分泌構(gòu)建了這種菌株。然后，作者構(gòu)建了一個簡單的模型來預(yù)測組氨酸營養(yǎng)不良菌株的（穩(wěn)態(tài)）生長速率差異。將此模型用于模型預(yù)測控制和 ReacSight 事件系統(tǒng)，作者可以以完全自動化的方式在平行生物反應(yīng)器（圖 4c，右）中保持兩種菌株的不同比率。然而，作者注意到穩(wěn)態(tài)誤差的系統(tǒng)存在。這種行為可能是由于慢菌株的生長速度意外恢復(fù)所致。由于在特征化實驗中未觀察到這種行為，作者假設(shè)這種差異是由于特征化或?qū)φ諏嶒炛惺褂玫陌被峁⿷?yīng)混合物的組成不同（除了組氨酸外，Sigma 的組氨酸缺失補(bǔ)充物比 Formedium 的完整補(bǔ)充物更豐富）。

圖 4 探索和利用適應(yīng)性、營養(yǎng)缺乏和細(xì)胞應(yīng)激之間的關(guān)系。a 由于共培養(yǎng)、自動細(xì)胞儀和反應(yīng)性實驗控制，結(jié)合單細(xì)胞基因分型和表型分型的實驗得以實現(xiàn)，以實時適應(yīng)環(huán)境條件。b 左上角：必需營養(yǎng)素的可用性（例如 his3 突變株的組氨酸）取決于環(huán)境供應(yīng)，也取決于通過營養(yǎng)素消耗的細(xì)胞密度。營養(yǎng)素供應(yīng)不足會阻礙生長速度，并可能引發(fā)細(xì)胞應(yīng)激。右上角：實驗設(shè)計。野生型細(xì)胞（標(biāo)記為 mCerulean 組成表達(dá)）與 his3 突變細(xì)胞共同培養(yǎng)。這兩個菌株都含有一個 UPR 應(yīng)激報告基因 mScarlet-I 的驅(qū)動表達(dá)。自動細(xì)胞儀能夠?qū)蝹€細(xì)胞分配給其基因型，并監(jiān)測菌株特異性 UPR 激活。這兩種菌株相對數(shù)量的動態(tài)可以推斷突變細(xì)胞和野生型細(xì)胞在每種情況下的生長速度差異。左下圖：兩種不同介質(zhì)組氨酸濃度下突變細(xì)胞適應(yīng)度缺陷的細(xì)胞密度依賴性。虛線表示野生型增長率對 OD 設(shè)定值的近似依賴性。右下角：每種情況下的菌株特異性 UPR 激活。c 左：雙應(yīng)變聯(lián)合體的原理，其組成可以通過 OD 控制來控制。右：實施和演示。異源難折疊蛋白的分泌被用作營養(yǎng)獨立的慢生長表型。使用模型預(yù)測控制和 ReacSight 事件系統(tǒng)對 OD 設(shè)定值進(jìn)行動態(tài)控制，類似于圖 3b （參見方法）。在時間 0 時開始藍(lán)光，并在整個實驗期間保持亮起，以誘導(dǎo)慢 his+菌株的慢生長表型。作者注意到系統(tǒng)存在穩(wěn)態(tài)誤差，測得的比率低于目標(biāo)值。在補(bǔ)充注釋 3 中，作者研究了限制控制性能的機(jī)制（慢生長表型的不穩(wěn)定性、菌株識別錯誤和模型中未考慮的延遲），還提供了其他控制實驗的結(jié)果。源數(shù)據(jù)作為源數(shù)據(jù)文件提供。

2.5
ReacSight 是一種通用策略：通過吸液功能增強(qiáng)平板閱讀器
為了說明 ReacSight 的通用性，將其作為通過連接實驗室設(shè)備來生長細(xì)胞和 /或測量細(xì)胞讀數(shù)以及吸管機(jī)器人來創(chuàng)建實驗平臺的策略，作者將 Tecan 平板閱讀器與 Opentrons 吸管機(jī)器人連接起來（圖 5a）。移液機(jī)器人和驅(qū)動讀板器的計算機(jī)通過 Flask 連接。因為無法訪問平板閱讀器的 API，所以再次使用了基于 pyautogui 的“點擊”控制策略。

在第一個應(yīng)用中，作者使用移液機(jī)器人在生長條件下長時間保持細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量。更具體地說，大腸桿菌臨床分離物在兩種不同的培養(yǎng)基（M9 葡萄糖加或不加 casamino 酸）中生長，并存在不同濃度的頭孢噻肟（CTX），一種β-內(nèi)酰胺抗生素。由于β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)，所選菌株對頭孢噻肟處理具有耐藥性。它對 CTX 的最低抑制濃度為 2 mg/L。當(dāng)細(xì)胞群 OD 的中位數(shù)達(dá)到目標(biāo)水平時，介質(zhì)將按照補(bǔ)償蒸發(fā)的策略更新（圖 5b，左）。通過所選策略，作者能夠在至少 15 代細(xì)胞中保持 OD 中值接近所選目標(biāo)（0.05 或 0.1）（圖 5b 右圖）。有趣的是，作者觀察到，當(dāng)用 1 mg/L 頭孢噻肟處理時，細(xì)胞在葡萄糖+酪氨酸鈉中的抵抗力比單獨在葡萄糖中更好。這有些令人驚訝，因為β-內(nèi)酰胺類抗生素通常對快速生長的細(xì)胞有更強(qiáng)的影響。

在第二個應(yīng)用中，作者使用該平臺測試了在不同細(xì)胞密度下應(yīng)用第二劑量頭孢噻肟的效果。這些實驗在概念上非常簡單，但其結(jié)果很難預(yù)測。低濃度頭孢噻肟抑制參與細(xì)胞分裂的 PBP3 蛋白，從而導(dǎo)致細(xì)絲形成，而高濃度頭孢噻肟則抑制參與細(xì)胞壁維持的 PBP1 蛋白，并導(dǎo)致細(xì)菌溶解。由于成絲作用，即使沒有細(xì)胞分裂，種群生物量在延長的時間內(nèi)也可能繼續(xù)呈指數(shù)增長。此外，死亡細(xì)胞釋放的β-內(nèi)酰胺酶在環(huán)境中降解抗生素。這導(dǎo)致了細(xì)胞死亡和抗生素降解之間的時間賽跑，絲狀物有助于延遲這一賽跑，同時增加生物量（圖 5c 左）。因此，在不同細(xì)胞密度下應(yīng)用第二劑量抗生素的實驗有可能啟發(fā)人們理解不同的作用（圖 5c 中間）。當(dāng)以 5 10−4 的光學(xué)密度開始時，單次處理的結(jié)果與分離物的 MIC 一致，因為高于 MIC 的處理會導(dǎo)致生長明顯停滯，而低于 MIC 的處理不會（圖 5c， “培養(yǎng)基處理”）。還可以觀察到，在前一種情況下，生長在數(shù)小時后恢復(fù)，這是酶介導(dǎo)的抗生素耐受的典型行為。這兩個觀察結(jié)果在使用 16 mg/L CTX 進(jìn)行第二次處理的情況下仍然有效。有趣的是，當(dāng)處理后生長停止時，OD 大約是處理時 OD 的 25 倍：12 10−3 ,6 10−2 和 12 10−2，處理時分別為 5 10−4 , 2.5 10−3 和 5 10−3。這表明，生長停止前活細(xì)胞對抗生素的降解是有限的，因此，生長停止之前只有有限數(shù)量的細(xì)胞死亡。因此，對抗生素處理的耐受性使細(xì)胞在死亡前的生物量增加了近 25 倍，然后由于酶介導(dǎo)的抗生素降解，使細(xì)胞在處理中存活下來，遠(yuǎn)遠(yuǎn) 超過其 MIC。還可以觀察到，當(dāng)初始處理為 4 mg/L 時，生長停止和再生之間的延遲相對恒定（~5 小時），與添加的抗生素總量無關(guān)（4 或 20 mg/L CTX）。這表明，生長停止后抗生素降解非常有效，延遲主要對應(yīng)于無法檢測到的再生所需的時間，此時活細(xì)胞的動態(tài)被死亡生物的光密度所掩蓋。在作者的條件下，當(dāng)?shù)谝淮翁幚碛行В? 或 16 mg/L）時，第二次處理似乎幾乎沒有效果。需要進(jìn)行深入研究，以更量化的方式調(diào)查這些影響。

圖 5 基于 ReacSight 的自動化平臺組裝，實現(xiàn)反應(yīng)控制和低容量細(xì)菌培養(yǎng)物的表征。a 平臺概述。Opentrons OT-2 移液機(jī)器人用于提高讀板器（Spark、Tecan）的容量。機(jī)器人用于在預(yù)先定義的 OD 處處理平板讀取器中的培養(yǎng)物。b 左：大腸桿菌臨床分離物可以通過以 OD 控制的方式更新培養(yǎng)基來維持在生長條件下。必須注意補(bǔ)償延長時間范圍內(nèi)的蒸發(fā)。右圖：富培養(yǎng)基中的細(xì)胞（葡萄糖+casaminoacids vs 單獨葡萄糖）生長更快，但抵抗更好的亞 MIC 抗生素處理。左：由于兩種效應(yīng)的結(jié)合，細(xì)菌種群可能表現(xiàn)出對處理的恢復(fù)力。在單細(xì)胞水平上，細(xì)胞可能通過絲狀化耐受超過其 MIC 的抗生素濃度�；诶w維的耐受性允許在細(xì)胞死亡之前增加生物量。在種群水平上，抗生素被環(huán)境中細(xì)胞死亡時釋放的酶降解。最終結(jié)果取決于細(xì)胞死亡和抗生素降解之間的競爭。中間：這兩種效應(yīng)的各自作用可以通過反復(fù)抗生素處理來研究。右圖：大腸桿菌臨床分離物在初始 OD 為 5 10−4 時用不同濃度的 CTX（圖例）處理，第二次使用 16 mg/L CTX（紅色）或單獨使用介質(zhì)（藍(lán)色），使用用戶定義的 OD （2.5 10−3 或 5 10−3 ). 由于儀器限制，OD 讀數(shù)低于 10−3 個可靠性較差。源數(shù)據(jù)作為源數(shù)據(jù)文件提供。

03
討論
作者報道了 ReacSight 的開發(fā)，這是一種通過自動測量和反應(yīng)實驗控制來增強(qiáng)多生物反應(yīng)器設(shè)置的策略。ReacSight 通過允許研究人員將低成本開放硬件儀器（如 eVOLVER、Chi.Bio）和多功能、模塊化、可編程移液機(jī)器人（如 Opentrons OT-2）與敏感但通常昂貴的獨立儀器相結(jié)合，構(gòu)建全自動化平臺，大大拓寬了可行實驗的范圍。作者還證明，ReacSight 可用于增強(qiáng)具有吸液能力的平板閱讀器。ReacSight 是通用的，易于部署，應(yīng)該廣泛用于微生物系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)社區(qū)。正如 Wong 及其同事所指出的，將多生物反應(yīng)器裝置連接到細(xì)胞儀進(jìn)行自動測量，可以實現(xiàn)微生物培養(yǎng)物的單細(xì)胞分辨特性。事實上，在微生物系統(tǒng)和合成生物學(xué)的背景下，自動化細(xì)胞術(shù)幾年前已經(jīng)被少數(shù)實驗室證明，但低吞吐量或依賴昂貴的自動化設(shè)備可能會阻礙這項技術(shù)的廣泛采用。來自連續(xù)培養(yǎng)物的自動細(xì)胞儀與最近開發(fā)的光遺傳學(xué)系統(tǒng)相結(jié)合，變得特別強(qiáng)大，能夠?qū)?xì)胞過程進(jìn)行有針對性、快速和成本效益的控制。作者使用 ReacSight 將兩種不同的生物反應(yīng)器設(shè)置（預(yù)先存在的自定義設(shè)置和最近的 Chi.Bio-optogenetic-ready 生物反應(yīng)器）與細(xì)胞儀連接起來。這證明了 ReacSight 戰(zhàn)略的模塊化，而使用 Chi Bio 生物反應(yīng)器的平臺版本說明了其他缺乏現(xiàn)有生物反應(yīng)器設(shè)置的實驗室如何能夠以較小的時間和財務(wù)成本（不包括細(xì)胞儀的成本，盡管其價格昂貴，但即使在缺乏自動化的情況下也已經(jīng)在實驗室中廣泛使用）構(gòu)建這樣的平臺。作者通過以全自動方式并在不同的反應(yīng)器中并行執(zhí)行（1）光驅(qū)動的基因表達(dá)實時控制，展示了該平臺的關(guān)鍵能力；（2）在嚴(yán)格控制的環(huán)境條件下，基于細(xì)胞狀態(tài)的競爭分析；動態(tài) 控制兩個菌株之間的比值。

然而，作者只觸及了這些平臺提供的巨大潛在應(yīng)用空間的表面。最近通過核糖體移碼技術(shù)證明，菌株條形碼可以擴(kuò)展到 20 株帶有兩個熒光團(tuán)的菌株，甚至可以擴(kuò)展到 100 株帶有三個熒光團(tuán)。這種多路復(fù)用能力對于并行描述各種候選路徑的輸入-輸出響應(yīng)（或菌株背景庫中路徑行為的依賴性）特別有用（在反應(yīng)器中使用不同的光感應(yīng)）。免疫珠可用于更多樣化的基于細(xì)胞術(shù)的測量（機(jī)器人可實現(xiàn)自動孵化和清洗，例如使用 Opentrons OT-2 磁性模塊）。表面顯示或 GPCR 信號等技術(shù)也可用于設(shè)計生物傳感器菌株，用單細(xì)胞儀測量更多培養(yǎng)物尺寸，無需試劑成本。除了高性能的定量菌株表征外，此類平臺還可用于生物技術(shù)應(yīng)用�；谧詣蛹�(xì)胞儀的人工微生物聯(lián)合體的組成，以及培養(yǎng)條件的動態(tài)控制（如本文所示，使用組氨酸營養(yǎng)不良和 OD），可以大大減少設(shè)計穩(wěn)健共存機(jī)制的需要，因此可以使用更大多樣性的聯(lián)合體。

未來，希望許多基于 ReacSight 的平臺將被組裝起來，它們的設(shè)計將被廣泛的社區(qū)共享，以大幅擴(kuò)展實驗?zāi)芰Γ瑥亩鉀Q微生物學(xué)的基本問題，并釋放合成生物學(xué)在生物技術(shù)應(yīng)用中的潛力。

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