發(fā)病機(jī)制
杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良（DMD）是X染色體連鎖遺傳疾病，以進(jìn)行性肌無(wú)力和消瘦為特征｡DMD基因位于Xp21.2-3，主要作用是產(chǎn)生抗肌萎縮蛋白，抗肌萎縮蛋白缺乏易造成肌肉斷裂及細(xì)胞內(nèi)鈣紊亂，從而導(dǎo)致肌肉壞死及細(xì)胞死亡；之后雖由周圍的衛(wèi)星細(xì)胞激活形成肌細(xì)胞再生，但最終也會(huì)因?yàn)樾l(wèi)星細(xì)胞的老化而使肌細(xì)胞再生停止，使肌肉組織最終被纖維脂肪浸潤(rùn)而失去肌組織功能。

DMD是容易發(fā)生突變的基因，且突變類型較多，包括小的缺失、插入、點(diǎn)突變及重復(fù)序列，或者是大片段的一個(gè)或多個(gè)外顯子缺失或序列重復(fù)，其中大片段缺失發(fā)生率高，大約占已發(fā)現(xiàn)突變的70-80%。突變常發(fā)生的熱點(diǎn)區(qū)域是外顯子45-53之間，其次是外顯子2-20。DMD基因突變類型的差異往往也反應(yīng)在疾病的癥狀的差異。有的突變?cè)谧x碼框外，干擾了翻譯讀碼框，造成抗肌萎縮蛋白缺失；而在讀碼框內(nèi)的突變，往往翻譯出的抗肌萎縮蛋白片段雖然不完整，但是具有一定的功能，患者的癥狀不嚴(yán)重，這種患者又被成為貝克肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（BMD）。DMD基因突變類型多樣，導(dǎo)致其臨床表現(xiàn)各異，可能每種臨床亞型所需的基因編輯策略不同^[1]。

動(dòng)物模型
目前DMD尚無(wú)治愈方法，各種治療手段大多處于試驗(yàn)研究階段，因此相關(guān)動(dòng)物模型的替代研究成為當(dāng)前的一個(gè)重點(diǎn)問(wèn)題。目前DMD動(dòng)物模型最常用的是小鼠和犬。

mdx小鼠模型：
mdx鼠是最常用于探索抗肌萎縮蛋白基因表達(dá)和功能的小鼠模型。這種模型的23號(hào)外顯子發(fā)生無(wú)義突變而導(dǎo)致終止密碼子提前出現(xiàn)，導(dǎo)致基因的表達(dá)提前終止，造成所編碼的蛋白縮短，由此引起全長(zhǎng)抗肌萎縮蛋白的表達(dá)缺失。對(duì)7周齡mdx小鼠的脛骨前肌 （tibialis anterior, TA）進(jìn)行抗肌萎縮蛋白的免疫熒光染色（圖1-A）和HE染色（圖1-B），結(jié)果顯示mdx小鼠TA肌細(xì)胞內(nèi)抗肌萎縮蛋白缺失，肌細(xì)胞皺縮，有較多中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。
 

 

圖1 mdx小鼠脛骨前肌(TA)肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白丟失和肌肉損傷；A.肌營(yíng)養(yǎng)不良的TA肌肉染色(比例尺=50μm);B.TA的HE染色(比例尺=50μm)

基因雙敲除（double knock out, DKO）鼠模型：
為了使mdx小鼠的肌肉表型與DMD患者更加相似，研究人員在mdx小鼠上設(shè)計(jì)了幾個(gè)額外突變，產(chǎn)生了DKO鼠。其中最常見(jiàn)的是抗肌萎縮蛋白基因與抗肌萎縮蛋白相關(guān)基因雙敲除鼠，即mdx/utrm^-/-鼠。這一鼠種呈現(xiàn)出較為嚴(yán)重的肌營(yíng)養(yǎng)不良表型，表現(xiàn)為嚴(yán)重的肌肉無(wú)力、關(guān)節(jié)攣縮和脊柱后突,且其平均生存期僅為3個(gè)月，這反過(guò)來(lái)支持了抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白對(duì)肌萎縮蛋白缺失有代償作用的說(shuō)法。而且，mdx/utrn^-/-鼠在DMD基因治療研究中是非常有用的，其表型在很大程度上可被抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白在肌肉內(nèi)特異性表達(dá)所緩解。

Dmd^mdx大鼠模型：
有學(xué)者提出用大鼠作為DMD的研究模型。大鼠比一般的mdx小鼠在行為表現(xiàn)上更具特征,其運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性也更為精確。為了產(chǎn)生這種抗肌萎縮蛋白缺陷的大鼠，他們通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases）使大鼠DMD基因第23號(hào)外顯子缺失。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Dmd^mdx大鼠表現(xiàn)出與DMD患者相似的肌肉損害，并以骨骼肌重量減輕、肌纖維壞死、纖維大小多變?yōu)樘卣�。此外，Dmd^mdx大鼠還伴有進(jìn)行性擴(kuò)張型心肌病的表現(xiàn)，因而Dmd^mdx大鼠對(duì)DMD心功能不全的研究也有重要意義｡

犬類模型：
犬類模型亦可用于DMD的研究，相比其它哺乳動(dòng)物模型肌營(yíng)養(yǎng)不良金毛獵犬（golden retriever muscular dystrophy, GRMD）可以更好地模仿人類抗肌萎縮蛋白缺乏癥。其包含一個(gè)抗肌萎縮蛋白基因突變，并表現(xiàn)出營(yíng)養(yǎng)不良的肌肉損傷、炎癥聚集、進(jìn)展性的纖維化和脂肪浸潤(rùn)、早期運(yùn)動(dòng)損害等，最終可因呼吸或心臟衰竭而提前死亡。這些臨床病理表現(xiàn)均與DMD患者極為相似，因而GRMD在DMD的治療研究中具有一定價(jià)值^[3]｡

治療方式
對(duì)癥治療藥物
Dystrophin蛋白缺失會(huì)導(dǎo)致一系列病理變化，包括肌肉萎縮、炎癥、鈣過(guò)載、氧化壓力、組織缺血等。針對(duì)這些病理變化過(guò)程的相關(guān)藥物治療可以使所有患者獲益，例如：

激素：是目前認(rèn)為能夠減慢DMD患者肌力和運(yùn)動(dòng)功能衰退的唯一藥物，長(zhǎng)期每日服用糖皮質(zhì)激素能明顯延緩患者病情進(jìn)展。它的作用機(jī)制主要是通過(guò)抑制NF-κB通路抑制炎癥，激活鈣調(diào)磷酸酶NF-AT通路抑制肌壞死。目前強(qiáng)的松和強(qiáng)的松龍是最常用的激素治療藥物，美國(guó)FDA批準(zhǔn)的地夫可特也可以用于DMD,且副作用更小。近年來(lái)正在研發(fā)溫和激素Vamorolone（VBP15），相對(duì)于傳統(tǒng)激素，能以更小的副作用獲得同等療效。

除此之外還有：抑制NF-κB的藥物、調(diào)節(jié)肌肉細(xì)胞中鈣水平的藥物、促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)藥物抗纖維化藥物、針對(duì)無(wú)義突變的通讀療法。

物理治療
適量的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練以及應(yīng)用矯形支具可以刺激DMD患者肌肉蛋白質(zhì)的合成,延緩呼吸衰竭,防止關(guān)節(jié)攣縮｡近年來(lái)有研發(fā)虛擬現(xiàn)實(shí) （VR）游戲訓(xùn)練方案以增加訓(xùn)練的趣味性，也有研發(fā)供DMD患者使用的機(jī)器人上肢外骨骼，是使DMD患者能夠繼續(xù)使用手臂功能的可移動(dòng)設(shè)備｡
 

圖2 適量運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練（圖片來(lái)自健康界）

基因治療
基因替代治療：
是在DMD患者的基因組中插入外源的功能性DMD基因，從而恢復(fù)DMD患者骨骼肌、心肌細(xì)胞表達(dá)有功能的抗肌萎縮蛋白（如圖3）。但由于DMD基因大，腺相關(guān)病毒（AAV）裝載容量有限，一般采用截短的微型DMD基因 （microdystrophin）。研究者在mdx小鼠模型中，局部注射缺少70％編碼序列的微型Dys，可保護(hù)mdx小鼠的四肢肌肉和心臟功能。同樣，在GRMD的犬模型中也實(shí)現(xiàn)了肌肉功能改善。但基因替代治療不適用于體內(nèi)含有抗AAV抗體的患者，這類患者約占所有DMD的50%，因?qū)Σ《疽職び忻庖叻磻?yīng)，可能對(duì)微型Dys本身產(chǎn)生體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)，故這類病人禁止接受AAV基因療法。目前，針對(duì)AAV介導(dǎo)的微型抗肌萎縮蛋白基因治療正開(kāi)展多項(xiàng)臨床試驗(yàn)，也有研究通過(guò)雙重腺相關(guān)病毒技術(shù)和慢病毒載體提高基因載體的容量，有望裝載全長(zhǎng)的DMD基因。

圖3 基因替代治療原理示意圖

外顯子跳躍治療：
是利用特異性反義寡核苷酸在DMD基因前信使RNA剪接過(guò)程中，排除特定外顯子以重建閱讀框，將突變類型糾正為整碼突變，這樣大多數(shù)DMD患者（見(jiàn)圖4）在理論上可以產(chǎn)生截短的、但功能正常的Dys，是DMD治療的又一策略（見(jiàn)圖5）。FDA在2016年批準(zhǔn)的eteplirsen是一種能夠跳躍51號(hào)外顯子的反義核苷酸，適用于大約13%的DMD患者治療。使用etepliesen長(zhǎng)期治療能促進(jìn)有功能的Dystrophin蛋白表達(dá)，延緩患者呼吸功能的下降，目前處于3期臨床試驗(yàn)。外顯子跳躍治療也具有其局限性，例如轉(zhuǎn)導(dǎo)不足、尤其是在心臟組織中，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低下，組織攝入不穩(wěn)定，需要頻繁用藥才能達(dá)到治療效果。為進(jìn)一步提高外顯子跳躍治療效率，對(duì)提高反義寡核苷酸的傳遞或吸收的研究正在進(jìn)行。
 

圖4 DMD突變示意圖
 

圖5 外顯子跳躍治療原理示意圖

基因編輯治療：
利用細(xì)胞自身的修復(fù)機(jī)制非同源末端鏈接（Non-homologous end joining, NHEJ）或同源重組（Homologous Recombination, HR）所致隨機(jī)插入和 （或）缺失，在原基因座位修復(fù)突變基因。工程核酸酶可通過(guò)切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的特定序列，誘發(fā)修復(fù)位點(diǎn)斷裂，從而達(dá)到原位基因編輯的目的（見(jiàn)圖6）。目前基因編輯治療仍處于體外細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，對(duì)于應(yīng)用于人體的安全性和有效性還需進(jìn)一步臨床試驗(yàn)證實(shí)。基因組編輯是在DNA水平上進(jìn)行的，因此被編輯基因產(chǎn)生的所有RNA轉(zhuǎn)錄本來(lái)都是自身產(chǎn)生的，理論上這就排除了重復(fù)治療的需要；但基因編輯治療不能完全預(yù)防與DMD相關(guān)的肌肉損傷，一旦發(fā)生大規(guī)模的肌肉損傷，多核纖維中前期已接受基因組編輯過(guò)的細(xì)胞核就會(huì)丟失。因此，患者仍有可能隨著時(shí)間的推移，部分Dys水平逐漸下降。DMD基因組編輯治療的長(zhǎng)期有效性，還需進(jìn)行長(zhǎng)期的研究。
 

圖6 基因組編輯原理示意圖

終止密碼子通讀治療：
又稱為無(wú)義突變通讀治療，一些化合物通過(guò)與核糖體的結(jié)合，阻止終止密碼子的信號(hào)識(shí)別，從而跳過(guò)這個(gè)錯(cuò)誤的終止密碼子，誘導(dǎo)提早出現(xiàn)的終止密碼通讀，從而繼續(xù)翻譯Dys（見(jiàn)圖7）。該方法適用于所有無(wú)義突變DMD患者，其占總患者人群的10％-15％。
 

圖7 終止密碼子通讀治療原理

干細(xì)胞療法
干細(xì)胞是一種具有自我復(fù)制能力并且可以分化成多種功能細(xì)胞的多潛能細(xì)胞。干細(xì)胞療法是將自體或同種異體干細(xì)胞移植到DMD患者體內(nèi)，使其分化成肌細(xì)胞并表達(dá)肌萎縮蛋白，從而治療患者。

DMD的研究中仍有許多問(wèn)題等待我們?nèi)ソ沂�。我們需要結(jié)合各種動(dòng)物模型，在各個(gè)層面對(duì)DMD從病因到治療進(jìn)行深入研究，最終實(shí)現(xiàn)治愈DMD的目的^[4-5]。

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參考文獻(xiàn)及引用圖片來(lái)源：

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