上回我們提到了一種“從小孔洞里看世界”的眼科疾病，即視網(wǎng)膜色素變性（Retinitis Pigmentosa, RP）。隨著病情加重，患者的視野會(huì)收窄變小至管狀，就像透過(guò)一個(gè)小孔洞看向四周，可見(jiàn)范圍十分有限，如此持續(xù)直至最終完全失明。作為一種慢性、遺傳性的視網(wǎng)膜退行性病變，RP相關(guān)的致病基因就有近百個(gè)，包括視紫紅質(zhì)（Rhodopsin, RHO）、Usher綜合征2A（Usher syndrome 2A, USH2A）和視網(wǎng)膜色素變性GTP酶調(diào)控因子（Retinitis pigmentosa gtpase regulator, RPGR）等。

其中，RHO合成的視紫紅質(zhì)與視覺(jué)電信號(hào)產(chǎn)生密切相關(guān)，該基因?qū)е铝思s25％的顯性RP遺傳，是最早發(fā)現(xiàn)且最常見(jiàn)的顯性RP致病基因。

RHO致病機(jī)理
RHO基因定位于3q21-24，長(zhǎng)度為6.952kb，包含4個(gè)內(nèi)含子和5個(gè)外顯子，其編碼的視紫紅質(zhì)蛋白主要在視桿細(xì)胞外節(jié)中表達(dá)，對(duì)于光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要。大多數(shù)RHO突變導(dǎo)致視紫紅質(zhì)在感光細(xì)胞中高表達(dá)水平，使得大量的突變蛋白細(xì)胞定位異常、聚集、蛋白質(zhì)降解嚴(yán)重超負(fù)，造成感光細(xì)胞凋亡，不能行使正常的光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。RHO突變型RP患者多于20歲前出現(xiàn)首發(fā)癥狀。

目前對(duì)RHO基因突變的研究認(rèn)為其致病機(jī)制主要為gain of function，包括影響了：（1）視紫紅質(zhì)蛋白質(zhì)折疊，造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力以及蛋白質(zhì)聚集體形成；（2）11-順式視黃醛結(jié)合，Ｇ蛋白偶聯(lián)活化，視紫紅質(zhì)抑制蛋白的結(jié)合與內(nèi)吞作用；（3）視紫紅質(zhì)的細(xì)胞運(yùn)輸，包括高爾基體后的運(yùn)輸靶向外段上膜等。

RHO基因突變類型
目前有超過(guò)150個(gè)RHO基因突變被鑒定與顯性RP相關(guān)，其中錯(cuò)義突變?yōu)橹鳌?/strong>RHO基因突變?cè)跉W美人群尤其是美國(guó)人群中突變率最高，而在亞洲人群中突變率較低。

P23H是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的RHO基因突變，在美國(guó)患者中約占12%，而在其他國(guó)家人群患者中卻很少發(fā)現(xiàn)。P23H的RHO基因突變導(dǎo)致蛋白不能正確折疊，造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力及細(xì)胞毒性，最終導(dǎo)致視桿細(xì)胞退化。視紫紅質(zhì)蛋白末端的347編碼區(qū)則是另一個(gè)基因突變的熱點(diǎn)，有6個(gè)不同的突變類型：P347T、P347A、P347S、P347Q、P347L、P347R，其中P347L最常見(jiàn)，在顯性RP中突變率為3.6%，僅次于P23H，國(guó)內(nèi)研究報(bào)道P347L是一個(gè)較常見(jiàn)突變位點(diǎn)^[2]。

RHO突變分為兩類：A類突變導(dǎo)致早期喪失夜間視力和整個(gè)視網(wǎng)膜的視桿功能異常；B類突變會(huì)導(dǎo)致更緩慢的疾病進(jìn)展，患者至少在視網(wǎng)膜的某些部分將正常的視桿感光細(xì)胞保留到成年期。從臨床表型來(lái)看，P347L較P23H更嚴(yán)重^[10]。

由于受影響細(xì)胞的生存能力延長(zhǎng)，B類突變患者更適合進(jìn)行基因治療。對(duì)于顯性疾病，治療可能需要抑制突變等位基因以避免其抑制作用；或通過(guò)基因校正，使用基因編輯來(lái)同時(shí)實(shí)現(xiàn)基因擴(kuò)增和突變抑制。幾乎所有特征化的RHO突變體都是顯性的，因此可能需要沉默突變等位基因以防止失明，同時(shí)需要增加正�；�因表達(dá)以便更好地治療疾病^[3]。

RHO現(xiàn)有基因療法盤(pán)點(diǎn)
動(dòng)物模型的應(yīng)用有助于推動(dòng)RHO相關(guān)的潛在治療方法向臨床試驗(yàn)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化，該基因突變導(dǎo)致的adRP嚙齒動(dòng)物模型包括：含有T17M、P23H、S334X或P347S等突變的人源化大小鼠模型。目前，靶向RHO基因以治療RP的基因療法有siRNA、ASO、CRISPR等。

▶siRNA療法
文獻(xiàn)中出現(xiàn)siRNA療法，但未見(jiàn)管線，該療法是一種表達(dá)shRNA的載體（抑制突變基因表達(dá)）和另一種表達(dá)替換視紫紅質(zhì)的載體（遞送正�；�因）對(duì)P347S和P23H轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行視網(wǎng)膜下注射，其中，shRNA能導(dǎo)致人類P23H-RHO轉(zhuǎn)基因小鼠中視紫紅質(zhì)的50%抑制。與未經(jīng)過(guò)治療的眼睛相比，用組合載體治療的眼睛的總視紫紅質(zhì)含量增加了兩倍，并在治療后9個(gè)月內(nèi)保護(hù)ERG反應(yīng)^[11]。

▶ASO藥物
ProQR公司的ASO藥物QR-1123治療與P23H RHO突變相關(guān)的adRP的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中（ClinicalTrials.gov標(biāo)識(shí)符：NCT04123626），疾病模型為P23H轉(zhuǎn)基因大小鼠^[9]。ASO可以通過(guò)靶向特異性基因序列調(diào)控蛋白質(zhì)表達(dá)。特異性ASO可能僅對(duì)特定突變患者群體有用，但由于ASO的開(kāi)發(fā)比病毒介導(dǎo)的反義技術(shù)更容易，因此如果存在測(cè)試系統(tǒng)（動(dòng)物模型或類器官模型），開(kāi)發(fā)針對(duì)罕見(jiàn)突變的治療性ASO是可行的^[8]。

▶CRISPR基因編輯
有文獻(xiàn)表明shRNA療法中小鼠視覺(jué)功能出現(xiàn)部分改善，然而相關(guān)研究結(jié)果對(duì)比并非十分明顯，或因RHO為活躍基因，在mRNA水平上干擾調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)水平具有挑戰(zhàn)，故而基因組編輯技術(shù)成為RHO基因治療研究熱點(diǎn)。

張鋒創(chuàng)立的Editas公布了其體內(nèi)基因編輯療法EDIT-103用于治療由于RHO突變導(dǎo)致的RP^[12]。EDIT-103是一種不依賴于突變的基于CRISPR/Cas9的基因編輯療法，使用雙AAV5載體遞送來(lái)敲除和替換視紫紅質(zhì)基因中的突變，以保持感光器功能，可通過(guò)視網(wǎng)膜下注射給藥。該療法有望解決150多種可導(dǎo)致RHO adRP病的RHO功能獲得型的突變。CRISPR療法的相關(guān)文獻(xiàn)中使用到的小鼠模型有P23H、P347S轉(zhuǎn)基因小鼠，hRHOC110R/WT人源化小鼠，同時(shí)具有多個(gè)突變的人源化小鼠模型等^[4,5,6,7]。不難發(fā)現(xiàn)，CRISPR療法中，疾病模型攜帶人突變基因是重要的共同因素，且人源化疾病模型小鼠在CRISPR治療中地位越來(lái)越重要。

基于自主研發(fā)的TurboKnockout融合BAC重組的技術(shù)創(chuàng)新，賽業(yè)生物可以提供RHO人源化及熱點(diǎn)突變?nèi)嗽椿�小鼠，以滿足廣大研發(fā)人員關(guān)于RP疾病的藥效學(xué)等實(shí)驗(yàn)需求。

眼科基因治療動(dòng)物模型推薦
在RHO基因突變導(dǎo)致的RP中，可應(yīng)用的基因療法較多，且目前大多基因治療處于臨床前期，發(fā)展前景樂(lè)觀。關(guān)于研發(fā)階段中所使用到的動(dòng)物模型，人源化小鼠無(wú)疑是大多數(shù)科研及藥企人員更青睞的選項(xiàng)，相信賽業(yè)生物為此布局的RHO人源化及熱點(diǎn)突變?nèi)嗽椿�小鼠能帶�?lái)更多的助力。