摘要
在大腸桿菌中生產(chǎn)重組蛋白時的困難之一是作為包涵體的錯誤折疊分子的積累，而這需要溶解和重折疊，否則就會失敗。化學重折疊通常是通過某種形式的緩沖液置換去除變性/增溶劑來實現(xiàn)的。我們比較了使用 µPULSE TFF 系統(tǒng)的緩沖液置換與傳統(tǒng)平衡透析來進行重組 α-淀粉酶的重折疊。µPULSE 提供了一些選項來定制過程，改變了緩沖液置換的速度和柔和度，從而對重折疊實驗產(chǎn)生影響。在最佳條件下，µPULSE上的重折疊速度比平衡透析快七倍，而且不會影響重組蛋白的產(chǎn)量或質(zhì)量。此外，使用 µPULSE 重折疊的樣品表現(xiàn)出約 8% 的比活，這表明新方法具有類似（如果比活不大于8%的話）的重折疊能力。由此我們得出結(jié)論，使用 µPULSE 的受控緩沖液置換是一種更快的蛋白質(zhì)重折疊方法，而且該方法可以優(yōu)化為與平衡透析一樣的溫和。
 
介紹
重組蛋白在大腸桿菌中的過度表達，尤其是真核來源的重組蛋白，通常會導致形成不溶性和無活性的包涵體 (IB)。重折疊這些包涵體是為了獲得具有生物活性蛋白質(zhì)的最后努力。我們使用變性劑對包涵體進行溶解，然后逐漸將變性劑去除。當變性劑從溶液中去除時，蛋白質(zhì)會重折疊。
所有重折疊方法都是基于緩沖液置換去除變性劑的原理。傳統(tǒng)來說我們使用平衡透析來完成蛋白質(zhì)重折疊，通過濃度梯度去除變性劑。平衡透析雖然溫和，但是過程緩慢，必須每隔一段時間手動更換緩沖液。此外，使用平衡透析無法有效控制緩沖液置換。而且，我們通過稀釋進行復性需要大型復性容器、較大的緩沖液體積 (50-100X) 以及隨后的樣品濃縮，這些因素使其成為一種高成本、長時間和多人工的方法。蛋白質(zhì)重折疊也可以使用柱色譜法完成，這種方法相對較快，但由于需要精心優(yōu)化，因此需要大量人工。最近，一種涉及使用微流體稀釋樣品的方法已被證明是非常有效的，但它只能處理微升的體積，不能用于制備目的（綜述于1）。
另一種有效的緩沖液置換方法是切向流過濾 (TFF)，它快速且可定制，可用于控制變性劑的去除2。然而，傳統(tǒng)的 TFF 系統(tǒng)體積龐大，截留體積高達數(shù)十至數(shù)百毫升。因而占地面積小且截留體積較低的 TFF 系統(tǒng)將是實驗室規(guī)模應用的理想選擇。在這里，我們使用 µPULSE-TFF 系統(tǒng)通過緩沖液置換演示了 α-淀粉酶的重折疊。

µPULSE-TFF系統(tǒng)
µPULSE 是一款完全自動化的無需看守的設備，專門服務于實驗室規(guī)模的過濾和濃縮。它使用的是 50 mL 的樣品管和一次性過濾芯片，這樣易于保持設備清潔并防止交叉污染。專有的隔膜泵是過濾芯片的組成部分，實現(xiàn)了 0.65 mL 的截留體積和高達 100% 的截留回收率。    
在傳統(tǒng)的 TFF 系統(tǒng)中，通過連續(xù)添加緩沖液來補充因滲濾而損失的溶液體積來實現(xiàn)緩沖液置換。µPULSE通過在不連續(xù)的操作步驟中自動將緩沖液添加到樣品中來實現(xiàn)緩沖液置換。在置換結(jié)束時通過滲濾去除的分子濃度 C 可表示為 ，其中 C0 是起始濃度，V0 是起始體積，Vstep 是步驟體積。假設在沒有嚴重污染的情況下去除明顯低于膜的 MWCO 的分子，簡化該表達式（有關更詳細的討論，請參見3）。顯然，為了最小化分子濃度 C，最好使步驟數(shù) n 最大化，同時保持比率 （V0-Vstep）/V0最小。換而言之，為了以最小的置換緩沖溶液體積實現(xiàn)最高置換，理想狀態(tài)是使步驟數(shù)最大化的同時保持步驟體積盡可能小。
過濾速度和膜表面的受力由平均跨膜壓力決定， ，其中 Pfeed 是進液壓力，Pretentate 是截留物離開膜的壓力（假設滲濾物側(cè)沒有背壓）。這些各自的壓力在 µPULSE 上指定為隔膜壓力 (DP) 和回流閥壓力 (RVP)。 TMP 越低，過程越溫和，然而速度也會越慢。

材料和方法
大腸桿菌 BL21-CodonPlus (DE3)-RIL 感受態(tài)細胞用重組載體 pET21-淀粉酶轉(zhuǎn)化并培養(yǎng)以產(chǎn)生重組 α-淀粉酶。超聲處理細胞裂解后，通過在 12000 g 下離心，將含有 α-淀粉酶的 IBs 從可溶性部分中分離出來。將 IBs 重新懸浮在混有 1% Triton X-100 的 50 mM Tris-Cl (pH 8.0) 中，并在冰上培養(yǎng) 2 小時，間歇混合。接著將樣品以 12000 g 離心并用 50 mM Tris-Cl (pH 8.0) 洗滌。然后將純化的 IBs 溶解在含有 8 M 尿素和 10% 甘油的 50 mL 50 mM Tris-Cl (pH 8.0) 中。將所得溶液等分到 10 mL 樣品（每個樣品 800 µg 淀粉酶）中，使用平衡透析和 µPULSE 系統(tǒng)同時進行蛋白質(zhì)重折疊。
為了使用平衡透析進行重折疊，我們將樣品裝入透析袋 (MWCO 10 kDa) 中并浸入含有 6 M 尿素的 100 mL 重折疊緩沖液中。每三個小時要將緩沖液置換為含有 4 M、2 M、1 M 和 0 M 尿素的緩沖液。重復 0 M 尿素步驟，過夜培養(yǎng)（13 小時）。µPULSE 的自動緩沖液置換向?qū)в糜趶淖冃?IBs 中連續(xù)去除尿素。對 DP 和 RVP（因此稱為 TMP）的不同組合進行了重折疊測試（表 1）。無論 TMP 是多少，緩沖液置換都分 67 個步驟進行，同時保持步驟體積為 0.75 mL。
   
結(jié)果與討論
蛋白質(zhì)重折疊時的主要目標之一是防止在去除變性劑時由于聚集體而導致樣品損失。在這項研究中，在使用任何一種方法對任何樣品進行重折疊的過程中均未觀察到聚集體形成。 使用 Bradford 測定的蛋白質(zhì)估算顯示所有回收樣品中的蛋白質(zhì)含量相等，表明樣品回收率約為 100%，如圖 3 所示。使用平衡透析法重折疊需要 28 小時才能完成。使用 µPULSE 系統(tǒng)，我們可以在更短的時間內(nèi)完成，同時完成快慢與壓力有關。即使在最低 TMP = 5.5 PSI 時，與平衡透析相比，重折疊也可以在 7 小時內(nèi)完成。 在最高 TMP = 27.5 PSI（圖 3）時，重折疊僅需 1.2 小時即可完成，這表明與平衡透析相比，µPULSE 系統(tǒng)的變性劑去除率要高得多。
   
為了確定每種蛋白質(zhì)重折疊技術(shù)的效率，我們比較了回收樣品的比活性。通過平衡透析重折疊的樣品表現(xiàn)出 48 U/mg 的比活性，而在最高壓力下使用 µPULSE 系統(tǒng)重折疊的樣品比活性要低約 42%。這可以解釋為在這些壓力下緩沖液突然置換和/或膜上的高剪切應力阻止分子實現(xiàn)正確的構(gòu)象。在較低壓力下處理的樣品表現(xiàn)出較高的比活性，與壓力成反比。有趣的是，樣品在 TMP = 12.5 PSI 時，µPULSE 系統(tǒng)在四小時內(nèi)完成重折疊的比活性比平衡透析在 28 小時內(nèi)完成的比活性高約 8%（圖 3），然而，當壓力的進一步降低時，比活性并未變高。我們可以理解為，在 TMP = 12.5 PSI 時，µPULSE 系統(tǒng)已經(jīng)實現(xiàn)了 100% 的重折疊效率，并且在這些設置下，該過程甚至比平衡透析更溫和。
 
總結(jié)
 µPULSE 是目前第一款真正的實驗室規(guī)模 TFF 系統(tǒng)，而且壓力可根據(jù)用戶定制。根據(jù)我們對重組 α-淀粉酶進行的評估，這款系統(tǒng)能夠用于蛋白質(zhì)重折疊。高壓會影響重折疊質(zhì)量和重折疊樣品的比活性。在最佳跨膜壓力下，使用 µPULSE 通過緩沖液置換對 α-淀粉酶進行重折疊的速度要比使用平衡透析快 7 倍，同時前者的比活性會略高。而且我們可以施加壓力使 µPULSE 系統(tǒng)進行蛋白質(zhì)重折疊時和平衡透析一樣溫和。 雖然這項工作是針對特定蛋白質(zhì)完成的，但無論目標分子是什么，相同的原理可能適用于任何緩沖液置換方案。
 
 
 1 - Singh, A., Upadhyay, V., Upadhyay, A.K. et al. Protein recovery from inclusion bodies of Escherichia coli using mild solubilization process. Microb Cell Fact 14, 41 (2015). https://doi.org/10.1186/s12934-015-0222-8
 
 2 - Ryś, S., Muca, R., Kołodziej, M., Piątkowski, W., Dürauer, A., Jungbauer, A., & Antos, D. (2015). Design and optimization of protein refolding with crossflow ultrafiltration. Chemical Engineering Science, 130, 290–300. https://doi.org/10.1016/J.CES.2015.03.035

 3 - Zeman, L. J. ,, A. L. Zydney, A.L. (1996). Microfiltration and Ultrafiltration - Principles and Applications. Marcel Dekker, New York.https://doi.org/10.1002/cite.330691022