化合物篩選是高通量篩選的主要也是基本用途，這種用途一般會結合前期機制研究 (如生信分析，基因組學或蛋白組學等進行靶點鑒定)，針對鑒定的靶點篩選相應抑制劑或激動劑，這種篩選模式我們稱為基于靶點的篩選 (target-based screening)；此外，也可基于當前研究疾病，直接構建相應疾病模型，再利用高通量篩選技術，篩選針對某種疾病表型的化合物，這種篩選模式我們稱為基于表型的篩選 (Phenotypic -based screening)^[1]。不管基于哪種篩選模式，最終目的是為了找到能夠對某種疾病具有治療價值的小分子化合物。上實例

 

纖維性疾病幾乎影響到身體的每一個組織，這種疾病的發(fā)生發(fā)展會迅速導致器官功能障礙、器官衰竭，最終導致死亡。成纖維細胞誘導細胞外基質 (ECM) 的大量沉積 (I 和 V 型膠原作為標志物) 是纖維化疾病的標志。 目前臨床可供使用的抗纖維化的藥物相對缺乏。2021 年，由 MichaelGerckens 等人開發(fā)了一種基于表型篩選開發(fā)新型抗纖維化藥物的方法，并鑒定出一系列具有較高活性的抗纖維化化合物^[2]。 

■ 篩選模型建立

首先作者建立了一種深度學習模型 (deep learning model)，可以對高通量顯微成像獲得的數(shù)千張細胞外基質 (ECM) 免疫染色圖片進行批量分析，以確定具有改善纖維化狀態(tài)的先導化合物。

 

圖 1. 提取自特發(fā)性肺纖維化患者的人原代肺纖維化細胞，在培養(yǎng)基中生長，用于高通量篩選模型^[2]

 

■ 高通量篩選

在 100 μM 濃度下，使用MCE FDA 批準上市庫進行篩選，通過顯微成像技術，最終得到 16 種陽性化合物 (圖 2a) 中，其中 Tranilast 在抑制基質沉積方面表現(xiàn)出良好的效果，并呈現(xiàn)出劑量依賴性 (圖 2b) ，并且已有文獻表明 Tranilast 在體內具有較好的生物利用度、安全性和耐受性的安全性，最終選定 Tranilast 作為先導化合物。

 

圖 2. 先導化合物的確認^[2]

圖 3.Tranilast 對 ECM 沉積表現(xiàn)出濃度依賴的抑制作用^[2]

■ 構效關系分析及先導化合物優(yōu)化

由于篩選到的 Tranilast 需要在較高濃度 (>150 μM) 下才會表現(xiàn)出較強的抗纖維化活性，所以作者還對 Tranilast 做了進一步結構優(yōu)化，希望從 Tranilast 結構類似物中篩選到具有更高活性的產(chǎn)品 (圖 4a)。通過對Tranilast結構類似物及合成的一系列結構類似物做進一步篩選，得到一系列 N-(2-butoxyphenyl)-3-(phenyl)acrylamides (N23Ps)，部分 N23Ps 具有較高的抗纖維化活性，抑制 ECM 沉積的 IC₅₀ 數(shù)值在 10 μM 以下 (圖 4b)。

圖 4. Tranilast 及 N23Ps 結構^[2]

■ N23Ps 作用機制研究

基上述活性篩選，作者團隊進一步進行了機制驗證；他們對纖維化組，纖維化+ N23Ps 組 (給藥組) 及空白組進行芯片轉錄組分析，發(fā)現(xiàn)一系列蛋白表達調控差異。通過對組學數(shù)據(jù)分析及基因功能關系分析，鑒定出 E3 連接酶 SMURF2 (TGFβ1 信號通路中重要的胞內信號因子) 可能參與了 N23Ps 對抗纖維化的調控。 

圖 5. 通過轉錄組分析及基因功能關系分析探究 N23Ps 作用機制^[2]

為了深入了解 N23P 調節(jié) TGFβ1 依賴性肌成纖維細胞轉分化的機制，使用 SMURF2 siRNA 敲低進行了功能丟失研究。cmp4 處理顯著抑制 TGFβ1 處理的 IPF-phLFs 中 αSMA 蛋白的表達; 但這種抑制在 SMURF2 缺失的 phLFs+TGFβ1+cmp4 的肌成纖維細胞中被阻止 (圖 6)，這表明 N23Ps 確實會通過 SMURF2 抑制的 TGF-β 通路參與抗纖維化調控。 

圖 6. N23Ps 可能的作用機制通路^[2]

除了上述應用，活性化合物庫由于具有明確的靶點及作用機制，常被用來進行機制研究。通過高通量篩選對得到的先導化合物進行靶點及作用機制的聚類分析，可以推測哪些靶點或通路可能參與了疾病調控，通過進一步驗證，可以揭示一些新的作用機制或靶點。一次篩選，相當于指明了后續(xù)研究方向。下面我們通過一篇 Claudia Capparelli 等科學家今年發(fā)表在 Nature Communications 上的文章為例看一下如何利用高通量篩選技術進行機制探究的^[3]。

■ 研究背景

SOX10 是黑色素瘤細胞中異質性表達的一種轉錄因子，SOX10 的缺失會降低細胞增殖，導致侵襲性，并促進對 BRAF 和/或 MEK 抑制劑的耐受性。為了解決藥物耐受問題，尋找能誘導 SOX10 缺陷細胞死亡的藥物，Claudia Capparelli 等人對 MCE 抗腫瘤化合物庫進行篩選。

■ 篩選模型建立

■ 機制探究
緊接著，為了驗證上述推測，進行了蛋白表達分析及基因組學分析，結果表明 cIAP2 表達與 SOX10 表達成負相關，cIAP2 參與誘導 SOX101 缺陷細胞死亡 (圖 8)，并找到了治療 RAF 和/或 MEK 抑制劑耐藥性的有效方案，即在 BRAFi 和 MEKi 方案中加入 cIAP1/2 抑制劑將延遲獲得性耐藥的發(fā)生。 

圖 8. SOX10 缺失在黑色素瘤中的調控機制^[3]

對于機制或表型復雜的疾病，篩選之前開發(fā)合適的篩選模型是實驗的重中之重，化合物庫可以用于新開發(fā)篩選模型的驗證。如 Jong-ChanPark 等科學家報道的一個基于信號網(wǎng)絡的高效阿爾茨海默病 (AD) 藥物篩選平臺，提出了數(shù)學建模和人類 iCO相結合的精準醫(yī)療策略^[4]。

 

為了建立該平臺，作者團隊進行了三個步驟：(i) 從 AD 參與者中生成 iPSC 衍生的類器官 (iCO) (源于 11 名參與者的 1300 個類器官被用于藥物評估平臺)。(ii) 通過對神經(jīng)元分子調控網(wǎng)絡的分析，提出了考慮神經(jīng)元動態(tài)的分子調控網(wǎng)絡數(shù)學模型，進行了基于系統(tǒng)生物學的AD路徑數(shù)學模擬 (包含信令網(wǎng)絡構建、網(wǎng)絡模型驗證、控制節(jié)點識別等步驟)。(iii)利用該篩選平臺對MCEFDA庫中的可透過血腦屏障化合物進行篩選,并通過高內涵篩選 (HCS) 成像系統(tǒng)定量 AD 發(fā)病程度, 驗證了所建立的篩選模型的可行性，并得到一系列在 AD 治療方面具有潛在應用價值的藥物。

圖 9. AD 藥物篩選平臺建立方案^[4]

高通量篩選技術已經(jīng)不再是制藥領域的專屬工具，它已經(jīng)逐漸成為科研領域進行基礎研究的重要工具。除了先導化合物的篩選，化合物新功能探究及疾病機制的研究等，對于某些機制或表型復雜的疾病，運用高通量篩選技術先建立合適的篩選模型是實驗的重中之重。相信高通量篩選技術將為學術機構在這方面研究發(fā)揮越來越大的推動作用。

 

相關產(chǎn)品

生物活性化合物庫 MCE收錄了15000+ 種具有明確報道的、活性已知、靶點明確的小分子化合物，包括天然產(chǎn)物，新型化合物，已上市化合物及處于臨床期化合物等，可以用于信號通路研究，新藥研發(fā)，老藥新用等不同的篩選目的。

FDA 上市庫 MCE收錄了2600+ 個批準上市的化合物，這些化合物已經(jīng)完成了廣泛的臨床前和臨床研究，具有良好的生物活性、安全性和生物利用度。

天然產(chǎn)物庫 MCE收錄了 3700+ 種天然產(chǎn)物，包括糖類和糖苷，苯丙素類，醌類，黃酮類，萜類，類固醇，生物堿，酚類，酸和醛等，天然產(chǎn)物化合物庫是一種有用的藥物開發(fā)工具。

片段化合物庫 MCE可以提供 17000+ 種片段化合物，這些化合物均符合“類藥 3 原則 (RO3)”，MCE 片段化合物庫是先導化合物的重要來源。

老藥新用化合物庫 MCE 老藥新用化合物庫包括 4000+ 種批準上市藥物及臨床Ⅰ期以后化合物，這些化合物已經(jīng)完成了廣泛的臨床前和臨床研究，具有良好的生物活性、安全性和生物利用度，特別適合藥物新適應癥的研究。

MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學研究或藥證申報，我們不為任何個人用途提供產(chǎn)品和服務。

 

  

參考文獻

[1] Wei Zheng, etc. Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery. Drug Discov Today. 2013 Nov;18(21-22):1067-73. 
[2] Michael Gerckens, etc. Phenotypic drug screening in a human fibrosis model identified a novel class of antifibrotic therapeutics. Sci Adv. 2021 Dec 24;7(52):eabb3673. 
[3] Claudia Capparelli, etc. Targeting SOX10-deficient cells to reduce the dormant-invasive phenotype state in melanoma. Nat Commun. 2022 Mar 16;13(1):1381. 
[4] Jong-Chan Park, etc. A logical network-based drug-screening platform for Alzheimer's disease representing pathological features of human brain organoids. Nat Commun. 2021 Jan 12;12(1):280.