本文要點(diǎn)：通常，長波長吸收近紅外II（NIR-II）染料在聚集態(tài)下熒光效率較低，對(duì)于聚集體引起的淬滅效應(yīng)，同時(shí)提高效率和延長吸收是NIR-II染料的一個(gè)挑戰(zhàn)。在這里，三種苯并[1，2-c：4，5-c']雙[1，2，5]噻二唑（BBT）衍生物（TPA-BBT，F(xiàn)T-BBT和BTBT-BBT）用于闡明熒光淬滅機(jī)制。當(dāng)BBT衍生物摻雜到小分子基質(zhì)中時(shí)，它們表現(xiàn)出完全不同的熒光行為。結(jié)構(gòu)扭曲的TPA-BBT表現(xiàn)出短程交換相互作用引起的熒光淬滅，而具有共面共軛骨架的FT-BBT和BTBT-BBT表現(xiàn)出濃度依賴性淬滅過程，即從長程偶極-偶極相互作用轉(zhuǎn)變?yōu)榻粨Q相互作用，這主要?dú)w因于吸收和發(fā)射之間的大量光譜重疊。通過精確調(diào)節(jié)摻雜濃度，F(xiàn)T-BBT和BTBT-BBT納米顆粒（NPs）在約2.5wt%摻雜濃度下呈現(xiàn)最佳的NIR-II熒光亮度。摻雜的NPs具有良好的生物相容性，可作為980 nm激光激發(fā)下高分辨率血管成像的熒光造影劑。這些范例證明，分子摻雜可以通過抑制長距離能量遷移來提高長波長吸收NIR-II熒光團(tuán)的熒光效率。
 

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背景：與短波可見光和近紅外I區(qū)（<900 nm）相比，近紅外II區(qū)（NIR-II，1000–1700 nm）的熒光生物成像具有深穿透深度、高信背景比和對(duì)低組織自發(fā)熒光和弱光物質(zhì)相互作用的出色分辨率。然而，除了一些聚甲基染料和半導(dǎo)體聚合物外，大多數(shù)有機(jī)NIR-II染料的最大吸收位于650-900nm范圍內(nèi)，短激發(fā)波長會(huì)嚴(yán)重限制成像分辨率和深度。雖然具有供體-受體-供體（D-A-D）結(jié)構(gòu)的有機(jī)熒光團(tuán)可以輕松調(diào)節(jié)光物理性質(zhì)，但長波長吸收的NIR-II熒光團(tuán)在聚集態(tài)下表現(xiàn)出嚴(yán)重的聚集引起的淬滅（ACQ）效應(yīng)。為了提高NIR-II熒光效率，分子結(jié)構(gòu)修飾已經(jīng)投入了許多努力。本文合成了三種具有扭曲或共面共軛主鏈的BBT衍生物，以闡明聚集態(tài)下的熒光淬滅機(jī)制（方案1）。結(jié)果表明，熒光淬滅主要源于具有共面結(jié)構(gòu)的FT-BBT和BTBT-BBT的長程偶極-偶極相互作用，具有扭曲結(jié)構(gòu)的TPA-BBT的短程交換相互作用。因此，將BTBT-BBT摻雜到低含量的基質(zhì)中可以阻斷長程能量遷移，而BTBT-BBT摻雜的NPs在980 nm激光激發(fā)下具有較高的熒光亮度，可進(jìn)一步用作NIR-II熒光造影劑來可視化血管系統(tǒng)。

方案1

 

研究內(nèi)容：為了擴(kuò)展有機(jī)染料的吸收曲線，共面構(gòu)型的供體-受體型分子結(jié)構(gòu)是一種有效的設(shè)計(jì)原則;同時(shí)，應(yīng)將大塊基團(tuán)固定在分子骨架上，以減少意外的分子間π-π堆積�；�于這一理念，設(shè)計(jì)并合成了BBT衍生物（BTBT-BBT）（圖1）。

圖1

 

此外，還合成了組合DBT作為分子基質(zhì)，晶體數(shù)據(jù)表明DBT具有完全共面和剛性結(jié)構(gòu)，丁苯基部分位于共軛面的兩側(cè)，因此可以合理推斷BTBT-BBT也具有共面結(jié)構(gòu)，并且塊側(cè)鏈可以阻礙π-π堆積（圖2D）。密度函數(shù)理論的理論計(jì)算表明TPA-BBT具有高度扭曲的結(jié)構(gòu)，扭轉(zhuǎn)角為∼26°和50°，而分子結(jié)構(gòu)在FT-BBT和BTBT-BBT中逐漸平坦化，BTBT-BBT采用全共面結(jié)構(gòu)，扭轉(zhuǎn)角為0°（圖2A–C）。過循環(huán)伏安法評(píng)估前沿分子軌道（圖2E，F(xiàn)），F(xiàn)T-BBT的最高占據(jù)分子軌道（HOMO）和最低未占據(jù)分子軌道（LUMO）分別為-5.16和-3.84 eV，BTBT-BBT的帶隙分別為-5.05和-3.85 eV，因此FT-BBT和BTBT-BBT的帶隙分別為1.32和1.20 eV。

圖2

 

進(jìn)一步研究了吸收和熒光的溶劑效應(yīng)。如圖3所示，由于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)，BBT衍生物在近紅外區(qū)域出現(xiàn)吸收帶。隨著溶劑極性的增加，TPA-BBT對(duì)甲苯和二氯甲烷的最大吸收峰分別為730和712 nm、FT-BBT為846和836 nm、BTBT-BBT為947和932 nm。在甲苯溶液中，TPA-BBT、FT-BBT 和 BTBT-BBT 的摩爾消光系數(shù)為 2.0 × 104， 3.8 × 104和 4.5 × 104 L摩爾−1厘米−1，分別表明分子構(gòu)象平面化可以明顯增強(qiáng)染料的吸收能力。與TPA-BBT相比，由于共面分子結(jié)構(gòu)促進(jìn)了共軛骨架上的電子離域，F(xiàn)T-BBT和BTBT-BBT的最大吸收峰有110和220 nm紅移。由于BBT基團(tuán)較強(qiáng)的電子接受能力，TPA-BBT、FT-BBT、BTBT-BBT表現(xiàn)出溶劑極性依賴性的NIR-II熒光發(fā)射，F(xiàn)T-BBT在甲苯和二氯甲烷的最大發(fā)射峰分別為998和1045 nm，而BTBT-BBT的則分別為1092和1178 nm。TPA-BBT在甲苯中具有以992 nm為中心的強(qiáng)熒光峰，在二氯甲烷中在1022 nm處具有較弱的熒光峰，表明TPA-BBT的熒光特性因其較強(qiáng)的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)而對(duì)溶劑極性更敏感。嘗試使用DBT作為基質(zhì)，并使用TPA-BBT，F(xiàn)T-BBT或BTBT-BBT作為摻雜劑來制造摻雜的NP。如圖3B，E，H所示，TPA-BBT，F(xiàn)T-BBT和BTBT-BBT的吸光度與摻雜含量呈線性關(guān)系，而TPA-BBT，F(xiàn)T-BBT和BTBT-BBT NPs的最大吸收峰分別保持在730，840和957 nm不變，表明不同摻雜含量體系中基態(tài)的分子構(gòu)象相同。如圖3C，F(xiàn)，I所示，隨著摻雜濃度從100wt%下降到1wt%，F(xiàn)T-BBT的最大發(fā)射峰從1081逐漸藍(lán)移到975 nm，BTBT-BBT的最大發(fā)射峰從1120 nm逐漸藍(lán)移到1062 nm，而TPA-BBT摻雜的NPs在937、1011和1100 nm處表現(xiàn)出不變且分辨率良好的發(fā)射帶，分別對(duì)應(yīng)于0-0、0-1和0-2振動(dòng)躍遷， 0-0和0-1發(fā)射帶的強(qiáng)度比隨著摻雜含量的降低而逐漸增大，這些BBT衍生物NPs的光譜變化可歸因于低摻雜含量下的弱自吸收效應(yīng)，而在長波長區(qū)域未觀察到低能量準(zhǔn)分子/激發(fā)復(fù)合體發(fā)射。

圖3

 

為了進(jìn)一步揭示熒光行為差異的根源，除摻雜濃度外，在相同條件下進(jìn)行了NIR-II熒光成像。如圖4A–C所示，當(dāng)摻雜含量從100wt%下降到25wt%時(shí)，NPs的熒光強(qiáng)度緩慢增加或減少，而趨勢在25wt%以下變化很大，表明25wt%是臨界摻雜含量。如圖4G所示，由于DBT基質(zhì)和NIR-II染料具有相似且較大的芳香族結(jié)構(gòu)，染料應(yīng)均勻分散到基質(zhì)中，臨界分子間距離（Dc） 由以下公式計(jì)算得出:

 

其中V是DBT的晶胞體積（∼5794.96 Å3）、Xc是臨界摻雜摩爾含量（XcTPA-BBT、FT-BBT和BTBT-BBT分別為=0.202、0.208和0.137），N是晶胞中DBT的數(shù)量（N=4），2V/N用于評(píng)估染料的體積。根據(jù)以上數(shù)據(jù)，DcTPA-BBT、FT-BBT和BTBT-BBT的計(jì)算值分別為25.5、25.2和28.4 Å。實(shí)際分子間距離可能大于Dc因?yàn)镈BT是無定形的，松散地堆積在NPs中。由于Dc與共軛骨架的分子長度相當(dāng)（圖2A），表明ACQ可歸因于交換相互作用（德克斯特能量轉(zhuǎn)移）。由于FT-BBT或BTBT-BBT摻雜NPs具有與稀土離子摻雜系統(tǒng)相似的濃度淬滅現(xiàn)象，NIR-II染料之間的相互作用類型可以通過以下公式估計(jì)：

 

其中I為熒光強(qiáng)度，x為摩爾摻雜含量，k和β為相同激發(fā)條件下的常數(shù)，θ為相互作用類型，θ=3、6、8、10分別表示與最近鄰分子的交換相互作用、偶極-偶極相互作用、偶極-四極相互作用和四極-四極相互作用。如圖4D–F所示，I/x和x的關(guān)系以對(duì)數(shù)圖繪制，−θ/3 是線性擬合的斜率，因此 TPA-BBT、FT-BBT 和BTBT-BBT 的θ值分別為 2.6、5.1 和 4.1。TPA-BBT的θ值接近3，表明濃度淬滅源于短程交換相互作用。而FT-BBT和BTBT-BBT的θ值大于3且接近6，表明濃度淬滅主要是由偶極-偶極相互作用引起的，即類似Föster的能量遷移。如圖2所示，TPA-BBT具有較大的斯托克斯位移（∼290 nm），吸收和發(fā)射光譜之間幾乎沒有重疊，NPs中的激子能量遷移僅通過短程交換相互作用發(fā)生（圖4H）。不太可能的是，由于結(jié)構(gòu)平面化和剛性，F(xiàn)T-BBT和BTBT-BBT都具有較小的斯托克斯位移（FT-BBT為135 nm，BTBT-BBT為102 nm），聚集態(tài)的吸收和發(fā)射之間存在較大的光譜重疊，激子能量遷移主要來源于長程偶極-偶極相互作用，導(dǎo)致聚集態(tài)的ACQ嚴(yán)重（圖4I）。因此，將長波長吸收的NIR-II染料摻雜到基質(zhì)中是克服長程淬滅效應(yīng)和提高熒光效率的有效方法。

圖4

 

由于摻雜濃度為2.5wt%的BTBT-BBT NPs在980 nm激光激發(fā)下的最大吸收峰為957 nm，熒光亮度最高，因此用于進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。首先，利用動(dòng)態(tài)光散射和透射電子顯微鏡（TEM）研究了NPs的尺寸分布和形貌，BTBT-BBT摻雜NPs表現(xiàn)出不規(guī)則的聚集NPs，流體動(dòng)力學(xué)尺寸和zeta電位分別為72.2 ±19.1 nm和−32.61 mV（圖5A）。通過2-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-3，5-二苯基-2H-四唑-3-溴化銨（MTT）測定法評(píng)估NPs的生物相容性，當(dāng)孵育濃度高達(dá)100μg/ mL時(shí)，三陰性乳腺癌細(xì)胞的活力仍約為90%（圖5B）。此外，活/死共染色測定還表明細(xì)胞保持高存活率（圖5C）。上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，2.5wt%摻雜的BTBT-BBT NPs具有良好的生物相容性，應(yīng)該可以安全地用作體內(nèi)成像造影劑。如圖5D所示，在尾部靜脈給藥后15分鐘后觀察到不同的血管解剖結(jié)構(gòu)，小鼠后肢主要血管的表觀寬度為∼0.42mm，信噪比為∼1.8（圖5E）。此外，BTBT-BBT摻雜NPs的藥代動(dòng)力學(xué)過程可以通過血管成像直接可視化。后肢主要血管的熒光強(qiáng)度在注射后1小時(shí)內(nèi)迅速降低，然后逐漸消失（圖5D）。體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)表明，BTBT-BBT摻雜的NPs可以作為一種優(yōu)秀的NIR-II熒光探針用于血管系統(tǒng)可視化。

圖5

 

綜上所述，新型NIR-II熒光團(tuán)BTBT-BBT具有以∼947 nm為中心的強(qiáng)吸收峰，具有完全共面構(gòu)象的吸收峰，在溶液中的QY為7.4%，而聚集體表現(xiàn)出嚴(yán)重的熒光淬滅。為了闡明其淬滅機(jī)理，詳細(xì)研究了3種BBT衍生物的光物理性質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熒光淬滅主要源于具有共面構(gòu)象的FT-BBT和BTBT-BBT的長程偶極-偶極相互作用，而具有扭曲結(jié)構(gòu)的TPA-BBT的短程交換相互作用。這些現(xiàn)象的原因可能在于吸收和熒光之間的光譜重疊程度，而較大的光譜重疊將通過非輻射途徑促進(jìn)類似Föster的能量遷移和能量耗散。結(jié)果表明，將BTBT-BBT摻雜到低含量（∼2.5wt%）的分子基質(zhì)中可有效阻斷長程能量遷移途徑，且BTBT-BBT摻雜的NPs在980 nm激光激發(fā)下具有較高的熒光亮度，可進(jìn)一步作為NIR-II熒光造影劑研究血管系統(tǒng)。

 

參考文獻(xiàn)

DOI: 10.1002/agt2.290

 

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