疾病概述
對于父母來說見證寶寶一點點學會走路，從獨立行走再到學會奔跑，是多么難忘的時刻！但對于患了杜氏肌營養(yǎng)不良罕見病的寶寶來說，他們不能用自己的雙腿走路、奔跑；對于普通人再平常不過的行動，對他們卻成了一種可望而不可及的夢想。

杜氏肌營養(yǎng)不良（duchenne muscular dystrophy, DMD）是一種X連鎖隱性遺傳的肌肉變性疾病，活產(chǎn)男嬰發(fā)病率為1/3500，女性多為致病基因攜帶者，發(fā)病者罕見，且癥狀較輕。在男患中癥狀較重，DMD發(fā)病年齡偏小，起病隱蔽，病程長，2-5歲患者全身骨骼肌進行性無力、萎縮和小腿腓腸肌假性肥大，走路呈現(xiàn)鴨步態(tài)、易摔跤、上下樓梯難，10歲左右因肌無力癥狀漸進性發(fā)展而不能行走，20歲左右會患心力衰竭或墜積性肺炎等消耗性疾病。目前該病發(fā)病機制尚未闡明且暫無有效治療方法�，F(xiàn)有治療只能減緩DMD患者肌肉萎縮進程，延長3-5年行走能力，增強心肺功能^[1-2]。
 

圖1 DMD患者小腿腓腸肌假性肥大

Dys基因結(jié)構、表達以及功能
Dys基因結(jié)構：DMD由抗肌萎縮蛋白（Dystrophin, Dys）基因突變所致，屬于進行性肌營養(yǎng)不良癥常見類型。已證實人類Dys基因定位于X染色體短臂上（Xp21.1-3），基因全長約2220kb，含79個外顯子，cDNA長14kb，是目前已知的最大人類基因。

全長型抗肌萎縮蛋白存在于骨骼肌的肌膜下，由3685個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為427KDa。共分為4個區(qū)域，如圖2B中的全長所示：（1）氨基端區(qū)域：與a-輔肌動蛋白（a-actinin）同源，包含第14-240氨基酸，跨越1-8號外顯子，與細胞內(nèi)的絲狀肌動蛋白（F-actin）相連接；（2）中央棒狀區(qū)：包含第253-3040氨基酸，跨越9-63號外顯子，由24個三聚螺旋狀重復結(jié)構（repeat, R）組成，每個重復結(jié)構由109個氨基酸組成，與a-肌動蛋白（a-actin）和血影蛋白（spectrin）同源。重復結(jié)構被4個富含脯氨酸的鉸鏈（hinge, H）結(jié)構分隔開，在4個鉸鏈結(jié)構處轉(zhuǎn)折形成三股螺旋狀結(jié)構；（3）富含半胱氨酸區(qū)域：第3080-3360氨基酸，跨越64-68號外顯子，與位于肌膜上的糖蛋白復合體相連，此區(qū)是與肌膜結(jié)合所必需的結(jié)構；（4）羧基端區(qū)域：第3361-3685氨基酸，跨越68-79號外顯子，含有許多磷酸化位點，與細胞內(nèi)的syntrophins蛋白相連。

Dys基因表達具有組織特異性。該基因由7個獨立的啟動子控制在不同組織中表達（圖2A）。其中有3個啟動子分別控制在大腦、肌肉和小腦浦肯野纖維中的表達，表達亞型為基因全長。3個全長亞型包括唯一的一個從1-79號外顯子的連接；另外4個內(nèi)部啟動子，啟動較短形式的抗肌萎縮蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，以DMD基因第30、45、56、和63號外顯子作為第一個外顯子啟動轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物分別為Dp260（Mr=260000）、Dpl40（Mr=140000）、Dpl16（Mr=116000）和Dp71（Mr=71000）。

圖2 抗肌萎縮蛋白基因及表達^[3]

A.位于Xp21，黑色的豎線代表分布于整個基因上的79個外顯子，黑色箭頭指示各組織特異性啟動子不同的啟動位點，分別以不同的字母縮寫來代表：B（腦皮質(zhì)）、M（肌組織）、P（蒲肯野纖維）、R（視網(wǎng)膜）、B3（腦組織）、S（雪旺細胞）和G（肌組織之外的多種組織器官）。

B.不同形式的抗肌萎縮蛋白及其區(qū)域組成：氨基端區(qū)域、中央棒狀區(qū)域、富含半胱氨酸區(qū)域及羧基端區(qū)域。

Dys的功能：Dys的羧基端和富含半胱氨酸的區(qū)域在整個框架蛋白中發(fā)揮作用，如圖3所示：Dys和抗肌萎縮蛋白聚糖（dystroglycans）、sarcoglycan、syncoilin、syntrophin和dystrobrevin等蛋白裝配在一起形成抗肌萎縮蛋白的結(jié)合蛋白復合物（dystrophin-associated protein complex, DAPC）。DAPC形成了一個穿過肌膜傳遞信號，連接細胞外基質(zhì)和細胞內(nèi)肌動蛋白骨架的重要結(jié)構。Dys基因表達的缺乏會影響DAPC的形成，使分子橋中斷，至少導致兩個結(jié)果：第一，細胞膜變得更脆弱，在肌肉離心性收縮的時候會被機械力破壞；第二，框架蛋白，尤其是對機械力敏感的離子通道將會失調(diào)^[3]。

圖3 抗肌萎縮蛋白及相關蛋白在肌細胞膜上的功能^[3]

抗肌萎縮蛋白的多樣性蛋白在細胞膜上形成了一種穩(wěn)定連接細胞外基質(zhì)和細胞內(nèi)骨架的連接結(jié)構
 

圖4 杜氏肌營養(yǎng)不良患者呈進行性肌營養(yǎng)不良
 

臨床檢測
DMD相關臨床檢測：

實驗室檢查
DMD血清檢測發(fā)現(xiàn)血清肌酸磷酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（GOT）等均增高，尤其是CK顯著增高，可達正常者的50倍。DMD血清學檢測值增高多發(fā)生在早期和進展期，在晚期不明顯，CK值增高是本病的特征性臨床表現(xiàn)，在患兒出現(xiàn)明顯的臨床癥狀前，已有顯著增加，特異性很高^[3]。

肌電圖
通常提示肌源性損害｡

肌肉活檢
早期表現(xiàn)非特征性，晚期出現(xiàn)肌細胞萎縮,脂肪、結(jié)締組織增生，免疫組化或免疫印跡提示抗肌萎縮蛋白明顯減少或消失。

超聲心動圖
擴張型心肌病改變｡

呼吸功能
提示呼吸肌無力,呼吸功能降低^[5]。

診斷進展
DMD新生兒篩查已在英國、德國、美國等國家進，其方法為以CK作為檢測指標,陽性召回病例經(jīng)DMD基因檢測確診，使DMD診斷進一步提前。浙江省篩查中心2016-2017年共篩查42862例浙江省出生男性新生兒,基因確診11例，發(fā)病率1：3896。DMD篩查不僅使患者得到早期診斷、早期治療，同時為有先證者家庭的下一胎產(chǎn)前診斷提供幫助，真正做到減少DMD缺陷患兒的出生。這可以通過絨毛膜取樣或羊膜腔穿刺技術完成。DMD篩查目前仍存在較高的假陽性率及假陰性率，有待進一步研究改進^[5]。

以往DMD診斷通常在患兒出現(xiàn)運動功能減退，腓腸肌肥大后，通過肌酸激酶、肌電圖及肌活檢證實。近年隨著基因檢測技術的快速進展及數(shù)據(jù)庫的積累，基因檢測已成為目前診斷DMD的主要手段｡DMD基因定位于Xp21，是至今為止已知的人類最大基因 （2500kb），包括79個外顯子、78個內(nèi)含子和8個啟動子。突變形式多樣，其中大片段缺失約占DMD65%；大片段重復約占DMD5%-10%；其余突變?yōu)槲⑿⊥蛔�，包括堿基的缺失、插入、置換、內(nèi)含子突變、復雜的染色體重排等。DMD患兒的臨床表現(xiàn)與患兒DMD的基因缺失之間的關系取決于基因突變是否對翻譯閱讀框架造成改變，即“閱讀框架規(guī)則”。大多數(shù)破壞閱讀框架的突變會導致Dstrophin蛋白質(zhì)的丟失，使患者產(chǎn)生DMD表現(xiàn)。當DMD基因突變存在于閱讀框內(nèi)時，可產(chǎn)生一種截短的、仍有部分功能的肌營養(yǎng)不良蛋白，使患者表現(xiàn)為臨床癥狀較為溫和的貝氏肌營養(yǎng)不良（becker muscular dystrophy, BMD）^[6]。也有少部分患者不符合閱讀框的假設，而這些異常的原因尚不清楚。

近年隨著DMD基因檢測的快速進展，出現(xiàn)一些通過基因型預測表型的軟件工具。有學者運用其開發(fā)的計算機軟件“DMD toolkit”，利用相關系數(shù)，回歸系數(shù)，譜系圖，直方圖，趨勢線的散點圖，莖葉圖等統(tǒng)計學方法來可視化突變位點結(jié)構和預測抗肌萎縮蛋白突變位點功能改變，并通過統(tǒng)計學方法預測DMD臨床表型^[5]。廣州罕見病基因治療聯(lián)盟的牽頭單位清華珠三角研究院聯(lián)合賽業(yè)生物開發(fā)了罕見病數(shù)據(jù)中心（RDDC）網(wǎng)站：https://rddc.tsinghua-gd.org/，RDDC對不同來源的同一基因信息進行了深度整合，以高度簡潔性和交互性提高研發(fā)者信息獲取效率，提供AI突變剪接預測、AI突變致病性預測等不同的工具為科研學者來帶便利，這些進展大大減少了有創(chuàng)性肌肉活檢，也使肌損傷前診斷成為可能｡