隨著生物技術的快速發(fā)展，生物藥物的品種與適應癥方面不斷優(yōu)化。抗體藥憑借其藥理活性高、特異性強、治療效果好的特點，在全球醫(yī)藥市場大放異彩。2021年FDA批準的8款抗體新藥中，4款為抗腫瘤藥物，2款為自免藥物，1款為阿爾茲海默癥藥物，1款為降血脂藥物。從藥物形式上看，包含5款單抗，2款ADC和1款雙抗。
 

 
隨著國內抗體藥的發(fā)展，抗體的靶點已由單一靶向轉向了多位靶向，抗體開發(fā)趨勢也呈現(xiàn)多樣化，開始更多轉向利用雙特異性抗體、抗體藥物偶聯(lián)物和抗體工程等技術開展，并且抗體純化工藝已相對成熟。

抗體生產工藝經(jīng)典流程圖
 

* 除了低pH孵育和除病毒過濾外，通常會選擇1~2種層析步驟，作為病毒去除的關鍵步驟。


1. 深層過濾

目前深層過濾開始普遍應用在澄清工藝步驟。深層過濾指的是利用多孔介質從流動相中截留固體顆粒而不是表面截留，且一般介質表面都帶有正電荷，可以通過靜電吸附的方式來攔截雜質顆粒。深層過濾介質一般由纖維素或聚丙烯纖維柱床、過濾介質（如硅藻土）和粘合劑 （用于制作平整的界面）組成。所以深層過濾用于細胞發(fā)酵液的澄清后便可獲得濁度較好的料液。由于深層過濾介質的孔徑并不均一，所以在深層過濾之后會緊接一個0.45μm或者0.2μm濾器的2級過濾工藝，以利于后續(xù)的層析純化。工藝時間短，效率高，也有去除更多的雜質等優(yōu)勢。目前工藝常用的深層過濾器pall, millipore, 3M的比較多，開發(fā)工藝也比較成熟。開發(fā)參數(shù)主要看Vmax（最大體積）,Tmax（最高濁度）和Pmax（最大壓力）。 

2. 蛋白A層析

此步驟工藝目的是把單抗從培養(yǎng)液中快速的捕獲出來的最關鍵步驟。因此步驟可以去除大量的HCP，病毒及HCD和培養(yǎng)基組分物質。百林科MaXtar ARPA填料的結合載量可達60mg/ml以上。
 

結果：MaXtar ARPA填料純化抗體樣品純度達到96.5%，回收率達到99%。

3. 低pH滅活

細胞表達產物有潛在的病毒安全性風險，因此要求純化工藝中有至少3種不同原理的病毒清除步驟。通常采用的步驟包括：層析步驟、低pH孵育、納濾等。低pH孵育，即將料液pH值調節(jié)至約3.4-3.7，維持至少1-2h（維持時間可以根據(jù)目的蛋白的穩(wěn)定性來確定），以實現(xiàn)病毒滅活的目的。有些蛋白在低pH不穩(wěn)定產生聚集，可以考慮加入去污劑，如TNBP/Tween 80等。
 
4. 陽離子層析

陽離子交換層析在純化工藝中起著非常重要的作用，可以達到很好的去除雜質效果，尤其是HCP和聚集體去除效果比較明顯。對陽離子交換層析來說，上樣洗脫條件的開發(fā)、填料的篩選對提高產品質量來說特別重要。對有些特殊單抗或者雙抗在陽離子交換層析過程中不僅收率低，純度也提不上去，這種情況推薦用疏水填料或者復合模式填料（MaXtar MMA,MaXtar MMC)來開發(fā)。
 
5. 陰離子層析

由于大部分單抗PI值大于7，在中性pH上樣條件下大部分蛋白帶正電荷，因此，在陰離子交換層析介質上表現(xiàn)出流穿模式。在這步驟不僅能去除雜質蛋白，聚集體，內毒素，最重要的是能去除病毒，更進一步提高藥物安全性。因大部分病毒在pH>7緩沖條件下帶負電荷，可以和帶正電荷的季銨基團結合，從而達到去除病毒的作用。對雙抗來說，大部分雙抗PI值比單抗低，有的能達到5左右，這時候可以用陰離子結合洗脫模式來純化。但這時候要注意洗脫緩沖液里面的氯化鈉濃度不能太高，不然會將有些雜質，病毒，內毒素都洗脫下來，達不到去除雜質效果。也可以考慮用復合填料，比如MaXtar MMA 或者MaXtar MMC。

6. 除病毒過濾

低pH病毒滅活法主要滅活脂包膜病毒，除病毒過濾濾膜既可以去除非脂包膜病毒，還可以去除脂包膜病毒。由于除病毒過濾濾器價格的昂貴和一次性使用的特性，導致除病毒過濾占用了整個生產工藝的很大一部分的成本。因此，優(yōu)化除病毒過濾濾器的載量顯得格外的重要。在病毒過濾過程中，常常發(fā)現(xiàn)由于各種因素可能會導致過濾通量降低，濾器載量降低。從濾器選擇、樣品pH與電導優(yōu)化、樣品濃度選擇和添加劑選擇這四個方面來優(yōu)化濾器的載量，以達到降低生產成本，節(jié)省過濾時間的目的。
 
7. UF/DF

這步驟目的主要是把樣品濃縮后換液到制劑緩沖液里。在這步驟要關注目的蛋白在高濃度下的穩(wěn)定性和合適的壓力。


訂貨信息

百林科不僅提供各種規(guī)格的層析填料，也提供預裝柱，以方便快速篩選。
 
 
   
 
參考文獻
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（2）A potential downstream platform approach for WuXiBody-based IgG-like bispecifific antibodies Gaili Guo, Jinyu Han, Ying Wang, Yifeng Li, /doi.org/10.1016/j.pep.2020.105647
（3）Removing a light-chain missing byproduct by MMC ImpRes mixed-mode chromatography under weak partitioning mode in purifying a WuXiBody-based bispecific antibody Ting Zhang 1 , Yan Wan 1 , Jiwei Duan, Yifeng Li ，/doi.org/10.1016/j.pep.2021.105927

（4）醫(yī)藥筆記：2021年FDA批準的8款抗體新藥