炎癥是機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一種保護(hù)效應(yīng)，在對(duì)抗機(jī)體感染，清除體內(nèi)異物，以及對(duì)局部組織損傷進(jìn)行修復(fù)等過程中發(fā)揮著重要作用。然而過度活化的炎癥反應(yīng)會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷，引起膿毒癥、糖尿病、心血管疾病、炎癥性腸病和神經(jīng)退行性疾病等一系列炎癥性疾病發(fā)生^[1-5]。在不斷進(jìn)化過程中，機(jī)體免疫系統(tǒng)已產(chǎn)生許多負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制對(duì)炎癥進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控，如IkB抑制NF-κB炎癥通路^[6]，A20抑制TRAF6信號(hào)通路^[7]，SOCS3抑制JAK2/STAT3炎癥通路^[8]等，這些研究都強(qiáng)調(diào)了負(fù)反饋調(diào)節(jié)在控制炎癥中的重要作用。

炎癥小體是機(jī)體重要的固有免疫炎癥蛋白質(zhì)機(jī)器，參與對(duì)病原的宿主免疫防御反應(yīng)。同時(shí)，炎癥小體也與眾多無菌性慢性炎癥疾病發(fā)生密切相關(guān)。因此，解析炎癥小體激活的調(diào)控機(jī)制對(duì)防治炎癥性疾病發(fā)生具有重要意義。然而，是否像其他炎癥反應(yīng)通路炎癥小體激活也存在精密高效的負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制目前尚不可知。

2022年11月2日，南京醫(yī)科大學(xué)楊碩課題組和南京中醫(yī)藥大學(xué)胡剛/王冰微課題組合作，在PNAS雜志發(fā)表題為“The Gasdermin D N-terminal fragment acts as a negative feedback system to inhibit inflammasome-mediated activation of Caspase-1/11”的研究論文，揭示了固有免疫細(xì)胞焦亡效應(yīng)分子GSDMD負(fù)反饋調(diào)控炎癥小體激活的作用及其分子機(jī)制，為靶向炎癥小體Caspases抗炎藥物開發(fā)提供了新線索。南京醫(yī)科大學(xué)姑蘇學(xué)院博士后胡穎超，生殖醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院博士研究生姜玉瑩和已畢業(yè)博士研究生李晟為本文的共同第一作者，南京醫(yī)科大學(xué)楊碩教授和南京中醫(yī)藥大學(xué)胡剛教授、王冰微教授為本文的共同通訊作者。
 

研究材料
體外研究使用了原代骨髓來源巨噬細(xì)胞（BMDM），永生化骨髓來源巨噬細(xì)胞（iBMDM），HEK293T細(xì)胞，體內(nèi)研究中研究人員構(gòu)建了髓系特異性GSDMD N端敲入小鼠（GSDMD N端Knockin小鼠由賽業(yè)公司提供）。

技術(shù)方法
蛋白印跡，F(xiàn)AM熒光探針，分子對(duì)接，免疫共沉淀，蛋白體外表達(dá)與純化，流式細(xì)胞術(shù)等。

技術(shù)路線

研究結(jié)果
研究人員通過骨髓來源巨噬細(xì)胞（BMDM）炎癥小體激活實(shí)驗(yàn)，意外發(fā)現(xiàn)焦亡效應(yīng)分子GSDMD缺失后炎癥小體激活顯著增強(qiáng)，提示GSDMD可能負(fù)反饋調(diào)控上游炎癥小體激活。

圖1 GSDMD負(fù)反饋調(diào)控炎癥小體激活^[9]

隨后研究人員采用分別穩(wěn)定表達(dá)GSDMD全長、N端、C端的永生化的骨髓來源巨噬細(xì)胞（iBMDM），進(jìn)一步證實(shí)GSDMD活化產(chǎn)生的N端片段可特異性抑制炎癥小體蛋白酶Caspase-1/11激活，進(jìn)而發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。

圖2 GSDMD通過N端發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)控效應(yīng)^[9]

隨后，研究人員構(gòu)建了帶有LSL表達(dá)盒的GSDMD N端序列Knockin小鼠（GSDMD-N^LSL，由賽業(yè)生物提供），與LysM-Cre工具鼠配繁，得到GSDMD N端片段髓系特異性敲入小鼠（GSDMD-N^LSL; LysM-Cre）。通過構(gòu)建小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）的多發(fā)硬化癥模型在體內(nèi)水平驗(yàn)證了GSDMD N端片段負(fù)反饋抑制效應(yīng)。
 

圖3 GSDMD N端抑制NLRP3炎癥小體激活進(jìn)而緩解EAE發(fā)生^[9]

為了解GSDMD N端抑制CASP1/11活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，研究人員接下來運(yùn)用分子對(duì)接方法并結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)GSDMD N端β1-β2環(huán)區(qū)段RFWK基序可通過疏水鍵和氫鍵等結(jié)合Caspase-1/11酶L1-L4口袋，進(jìn)而干擾Caspase酶催化活性中心。

圖4 GSDMD N通過β1-β2區(qū)段RFWK基序結(jié)合抑制CASP1/11^[9]

最后，研究人員設(shè)計(jì)了基于RFWK基序的小分子多肽抑制藥物Ac-RFWK-CMK。Ac-RFWK-CMK可以抑制Caspase-1/11的活化及其下游底物GSDMD和IL-1β的剪切，以及脂多糖誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥。

圖5 Ac-RFWK-CMK抑制Caspase-1/11剪切和炎癥小體激活^[9]

研究結(jié)論
綜上，該研究首次揭示了炎癥小體下游的負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)焦亡效應(yīng)分子GSDMD可通過活化產(chǎn)生的N端片段β1-β2環(huán)RFWK基序作用炎癥小體蛋白酶Caspase-1/11酶催化中心，進(jìn)而控制炎癥小體Caspase的過度激活和炎癥反應(yīng)發(fā)生。

該研究拓展了我們對(duì)GSDMD蛋白功能的認(rèn)識(shí)，為靶向炎癥小體Caspases的抗炎藥物開發(fā)提供了新線索。

參考文獻(xiàn)：
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[5] Amor, S., et al., Inflammation in neurodegenerative diseases. Immunology, 2010. 129(2): p. 154-69.

[6] Peng, B., et al., Defective feedback regulation of NF-kappaB underlies Sjogren's syndrome in mice with mutated kappaB enhancers of the IkappaBalpha promoter. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010. 107(34): p. 15193-8.

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[8] Carow, B. and M.E. Rottenberg, SOCS3, a Major Regulator of Infection and Inflammation. Front Immunol, 2014. 5: p. 58.

[9] Yingchao Hu, Yuying Jiang, Sheng Li, et al.The Gasdermin D N-terminal fragment acts as a negative feedback system to inhibit inflammasome-mediated activation of Caspase-1/11. PNAS. November 2, 2022. doi: 10.1073/pnas.2210809119
 

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Gsdmd基因敲除小鼠

品系名稱：
C57BL/6N-Gsdmd^em1Cya
品系編號(hào)：
KOCMP-69146-Gsdmd-B6N-VA
產(chǎn)品編號(hào)：
S-KO-12963
應(yīng)用方向：
發(fā)育生物學(xué),免疫系統(tǒng),生理系統(tǒng),造血系統(tǒng),細(xì)胞生物學(xué),分子生物學(xué)
打靶方案：