本文要點(diǎn)：近紅外II（NIR-II）光學(xué)窗口中的熒光發(fā)射可減少自發(fā)熒光和光散射，使疾病檢測(cè)和手術(shù)導(dǎo)航的深部組織可視化。小分子NIR-II染料是臨床生物成像應(yīng)用的首選，因?yàn)槠浞肿雍铣傻撵`活性允許精確控制其光學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)特性。在各種類型的染料中，基于供體-受體-供體（D-A-D）染料表現(xiàn)出優(yōu)異的光穩(wěn)定性，而常用的PEG化方法由于其固有的自組裝效應(yīng)，在水環(huán)境中不能保持足夠的固有亮度。本文證明了市售表面活性劑可以作為分散劑來防止PEG化D-A-D染料的分子聚集。由于D-A-D染料和表面活性劑之間共組裝的有利能量，形成的表面活性劑-修飾染料策略顯著提高了染料亮度。因此，這種方法為體內(nèi)生物成像應(yīng)用提供了顯著的改進(jìn)性能。同時(shí)，本文還研究了小鼠模型肝臟中的D-A-D染料攝取和信號(hào)增強(qiáng)特性，并證明腔內(nèi)的Kupffer細(xì)胞可以潛在地分解PEG化的D-A-D聚集體，從而恢復(fù)其固有的亮度。
 

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背景：與在可見光/NIR-I光譜區(qū)域發(fā)射熒光的傳統(tǒng)熒光團(tuán)相比，近紅外-II（NIR-II）小分子染料成像具有更大的穿透深度，低自發(fā)熒光和相對(duì)較低的生物毒性，因此可以獲得對(duì)比度更高的圖像。由于NIR-II熒光發(fā)射熒光團(tuán)通常具有延伸的疏水π共軛基團(tuán)，染料需要用額外的親水基團(tuán)包括烷基磺酸鹽、烷基羧酸鹽和聚乙二醇（PEG）分子及其眾多衍生物進(jìn)行改性，以賦予水溶性和生物生物相容性。當(dāng)前NIR-II熒光基團(tuán)從油相過渡到水相時(shí)的熒光猝滅仍然是其成功進(jìn)入臨床的主要障礙。這種亮度損失歸因于聚集引起的淬滅（ACQ）現(xiàn)象效應(yīng)。NIR-II熒光D-A-D染料表現(xiàn)出優(yōu)異的光穩(wěn)定性，從而消除了實(shí)施時(shí)光漂白的任何擔(dān)憂。為了提高亮度，通常使用PEG分子，因?yàn)樗鼈兛梢杂米髌帘螁卧�（S），能夠調(diào)節(jié)NIR-II熒光S-D-A-D-S染料的量子產(chǎn)率和藥代動(dòng)力學(xué)特性。據(jù)推測(cè)，廣泛的PEG化可以改變S-D-A-D-S染料的溶解度，使它們轉(zhuǎn)化為兩親性分子，因此本質(zhì)上傾向于自組裝。這種不可避免的聚集效應(yīng)是所有先前報(bào)道的NIR-II D-A-D染料的常見問題。即使在非常低的濃度下，這些染料的自組裝淬滅行為也可能發(fā)生。本文合成了兩種S-D-A-D-S小分子染料，作為研究分子間組裝和隨后的NIR-II熒光發(fā)射的淬滅的模型系統(tǒng)。合理的供體替代提高了S-D-A-D-S熒光團(tuán)的NIR-II量子產(chǎn)率。發(fā)現(xiàn)商業(yè)表面活性劑可有效防止我們制備的PEG化S-D-A-D-S染料的聚集/自組裝。因此，表面活性劑修飾的S-D-A-D-S染料在水溶液和體內(nèi)成像中的量子產(chǎn)率顯著提高。

 

研究內(nèi)容：1、通過合理的供體取代設(shè)計(jì)合成D-A-D分子：文獻(xiàn)報(bào)道，許多NIR-II熒光團(tuán)的S-D-A-D-S結(jié)構(gòu)具有特殊的光穩(wěn)定性，從而為長時(shí)間的體內(nèi)成像應(yīng)用提供生物事件的長期可視化潛力。近年來，供體基團(tuán)的烷基異構(gòu)化備受關(guān)注。這種對(duì)受體電子的整體電子離域進(jìn)行供體特異性修飾并進(jìn)一步增強(qiáng)發(fā)射波長的想法最近也引起了研究人員的興趣。然而，這種調(diào)整也降低了分子扭曲角。這可能導(dǎo)致電荷轉(zhuǎn)移特性降低，從而強(qiáng)調(diào)非常強(qiáng)的受體效應(yīng)，最終導(dǎo)致更強(qiáng)的組裝淬滅趨勢(shì)。為了進(jìn)一步證實(shí)這些猜想，作者設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)S-D-A-D-S結(jié)構(gòu)異構(gòu)體（Figure.1a），IR-FH4和IR-FH3。高斯計(jì)算表明，在4C位上取代烷基的IR-FH4具有較小的光學(xué)帶隙和基態(tài)二面角（Figure.1bc）。結(jié)果表明，4C染料在基態(tài)上的二面角較小，表明該結(jié)構(gòu)的電子結(jié)構(gòu)更加離域。BBTD和噻吩在4C染料中的二面角僅為0.8°，導(dǎo)致了更長的吸收、發(fā)射波長，以及更高的熒光量子產(chǎn)率。然而，熒光光譜表征顯示，與DMSO相比，IR-FH4P的水溶液減少了20倍（Figure.1d）。與DMSO相比，吸收光譜在水溶液中也顯示出強(qiáng)烈的藍(lán)移（Figure.1e）。

Figure 1

 

2、商業(yè)表面活性劑有效地克服了PEG化S-D-A-D-S染料的固有聚集/組裝：使用透射電子顯微鏡（TEM）表征，作者驗(yàn)證了IR-FH4P在溶解在PBS緩沖液中時(shí)固有地形成相對(duì)較大的納米顆粒（約80 nm）（Figure.2a）。相反，它很好地分散在有機(jī)溶劑中，例如氯仿。基本上，IR-FH4P形成大的球形納米顆粒，導(dǎo)致在水環(huán)境中熒光猝滅。即使在非常低的濃度下，D-A-D熒光近紅外染料仍然形成納米顆粒的聚集/組裝。然而，IR-FH4P供體基團(tuán)的異構(gòu)化通過減小結(jié)構(gòu)扭曲角放大了這種聚集/組裝效應(yīng)。在D2O和 DMSO-D2O系統(tǒng)中IR-FH4P的典型化學(xué)位移隨著峰寬的增加而大大減弱，與CDCl3中可預(yù)測(cè)的精確信號(hào)相反(Figure.2c）。這種現(xiàn)象與以往大環(huán)分子和聚集體誘導(dǎo)發(fā)射（AIE）分子的自組裝一致，表示IR-FH4P的聚集特性。隨著對(duì)熒光猝滅和分子聚集之間關(guān)系的廣泛理解，它促使我們通過利用表面活性劑等增溶技術(shù)來解決這一緊迫的挑戰(zhàn)。因此，我們采用了一種常用的表面活性劑Triton-X100（Triton）來分解IR-FH4P納米顆粒。DLS數(shù)據(jù)顯示，Triton-X100修飾的IR-FH4P經(jīng)歷了中間狀態(tài)（DLS測(cè)試中的大直徑），最終轉(zhuǎn)變?yōu)榱黧w動(dòng)力學(xué)直徑約8 nm的拆卸狀態(tài)，類似于其在有機(jī)相中的完全溶解狀態(tài)（Figure.2e）。繪制七種不同濃度的 IR-FH4P 和 Triton-X100 混合物的 DLS 大小，使我們能夠確定在水溶液中完全分解IR-FH4P的最低Triton-X100濃度（0.1% w/w）（Figure.2f）。

Figure 2

 

為了進(jìn)一步驗(yàn)證該策略的可行性，同時(shí)使用了五種常見的表面活性劑來測(cè)試亮度增強(qiáng)。與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一致，作者發(fā)現(xiàn)大多數(shù)測(cè)試的表面活性劑，包括陰離子、陽離子和非離子表面活性劑，都能有效提高IR-FH4P的NIR-II亮度，恢復(fù)到與其有機(jī)相對(duì)應(yīng)物相同的亮度水平（Figure.3a）。值得注意的是，當(dāng)添加等量的Triton-X100時(shí)，異構(gòu)體IR-FH3P僅表現(xiàn)出3倍的亮度增強(qiáng)，這表明對(duì)不同S-D-A-D-S結(jié)構(gòu)使用表面活性劑的溶解度存在差異，結(jié)構(gòu)優(yōu)化是必要的（Figure.3b）。為了研究表面活性劑和染料體系的分解機(jī)理，作者通過IR-FH4P與三種典型表面活性劑混合測(cè)試了一組樣品的尺寸演變（Figure.3c）。正如預(yù)期，表面活性劑修飾染料優(yōu)先在較低的表面活性劑濃度下形成共組裝的納米顆粒，而當(dāng)不含表面活性劑時(shí)，它們基本上無法在水溶液中自組裝。從DLS（Figure.3d）的結(jié)果來看，隨著DMSO-PBS混合溶液中DMSO含量的變化，染料聚集體的粒徑表現(xiàn)出與梯度濃度表面活性劑體系相似的變化趨勢(shì)。由于表面活性劑通常對(duì)生命系統(tǒng)有毒，作者接下來使用純?nèi)玖�，純表面活性劑和染�?表面活性劑混合物進(jìn)行了細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，在等效給藥劑量下，染料/表面活性劑混合物的毒性明顯低于單一表面活性劑（Figure.3ef）。染料/表面活性劑探針的毒性顯著降低，進(jìn)一步證明了表面活性劑和IR-FH4P共組裝成穩(wěn)定的伴侶，從而消除了其在體內(nèi)應(yīng)用的毒性問題。為了進(jìn)一步確認(rèn)該策略的低毒性，通過蘇木精和伊紅（H&E）染色對(duì)生理鹽水，IR-FH4P和IR-FH4P / Triton給藥的小鼠的肝臟進(jìn)行病理分析也驗(yàn)證了沒有明顯的異常形態(tài)（Figure.3g）。

Figure 3

 

3、表面活性劑修飾的S-D-A-D-S染料在體內(nèi)顯著增強(qiáng)了NIR-II的亮度我們靜脈注射表面活性劑修飾的IR-FH4P和不含表面活性劑的IR-FH4P以比較它們的體內(nèi)性能，以評(píng)估表面活性劑修飾的染料在體內(nèi)的增強(qiáng)亮度（Figure.4ab）。IR-FH4P/Triton-X100 組的 NIR-II 信號(hào)在短時(shí)間內(nèi)遠(yuǎn)高于不含表面活性劑的IR-FH4P 組（IR-FH4P/Triton-X100 型號(hào)在 60 秒時(shí)間點(diǎn)增強(qiáng)約 12 倍）。無表面活性劑的IR-FH4P注射組的肝臟和皮膚/肌肉信號(hào)隨著時(shí)間的推移而增加，并在24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)達(dá)到與IR-FH4P / Triton-X100組相同的范圍（Figure.4c-f）。總的來說，表面活性劑修飾的IR-FH4P在24h內(nèi)提供了顯著的亮度增強(qiáng)，這可能是解決NIR-II熒光發(fā)射S-D-A-D-S染料固有的分子間聚集和熒光猝滅問題有希望的策略。

Figure 4

 

4、表面活性劑修飾的NIR-II熒光團(tuán)可實(shí)現(xiàn)高效腫瘤和淋巴結(jié)成像：在建立了表面活性劑修飾染料策略的體內(nèi)生物成像能力后，作者研究了IR-FH4P和IR-FH4P / Triton-X100是否可以在小鼠模型中提供高效的淋巴結(jié)（LNs）成像。為此，將剃光的Balb / c小鼠主要用于腘窩和骶部LNs成像。在右腳墊上皮內(nèi)注射IR-FH4P / Triton-X100混合物（100μM，25μL），同時(shí)在左腳墊上注射等效染料劑量的不含表面活性劑的IR-FH4P。如Figure.5ab所示，顯然記錄了非常不同的NIR-II熒光強(qiáng)度，并且在前30分鐘內(nèi)使用IR-FH4P / Triton-X100和不含表面活性劑的IR-FH4P之間大約有3倍的亮度增強(qiáng)。作者還研究了IR-FH4P / Triton-X100染料在LN成像中是否保持了D-A-D染料出色的光穩(wěn)定性。在PBS和IR-FH4P / Triton-100X混合物中皮內(nèi)注射等效劑量的ICG（OD808nm=0.5），并通過上述相同條件進(jìn)行比較（Figure.5cd）。左側(cè)注射ICG的NIR-II信號(hào)在前30分鐘內(nèi)迅速減弱，而右側(cè)注射的IR-FH4P/Triton-X100的LN信號(hào)保持一致。接下來，作者用靜脈注射IR-FH4P / Triton-X和不含表面活性劑的IR-FH4P對(duì)兩組4T1腫瘤小鼠的腫瘤進(jìn)行了成像。將兩組腫瘤信號(hào)與注射后時(shí)間做對(duì)比，發(fā)現(xiàn)與不含表面活性劑的IR-FH4P注射組相比，IR-FH4P / Triton-X100的峰值積累延遲很多（72小時(shí)與24小時(shí)）（Figure.5e）。值得注意的是，注射IR-FH4P / Triton-X100組表現(xiàn)出約2倍的信肌比增強(qiáng)（Figure.5f）。

Figure 5

 

5、NIR-II S-D-A-D-S熒光基團(tuán)在肝臟和Kupffer細(xì)胞中的熒光增強(qiáng)機(jī)制：和以前的報(bào)告反復(fù)觀察到，靜脈內(nèi)施用一系列PEG化的S-D-A-D-S熒光團(tuán)后，肝臟信號(hào)逐漸增加。以前的報(bào)道將這種現(xiàn)象完全歸因于它們的大尺寸和長血液循環(huán)。上述表面活性劑修飾策略促使作者重新確定這些歸因，因此作者認(rèn)為巨噬細(xì)胞也可能分解S-D-AD-S熒光團(tuán)（這將導(dǎo)致其NIR-II亮度增強(qiáng)）。在這種情況下，隨著時(shí)間的推移，肝臟中的信號(hào)增強(qiáng)大致可以分為兩個(gè)階段：熒光團(tuán)積累階段和熒光團(tuán)分解階段。這兩個(gè)階段都可以增強(qiáng)肝臟中積累的熒光團(tuán)的NIR-II熒光信號(hào)。在第一階段，游離染料在循環(huán)時(shí)積聚在肝臟（例如Kupffer細(xì)胞）中，從而產(chǎn)生一定的亮度增強(qiáng)。染料在第二階段被Kupffer細(xì)胞進(jìn)一步分解，肝臟顯示出進(jìn)一步增強(qiáng)的熒光信號(hào)（Figure.6a）�；�于這一假設(shè)，Kupffer細(xì)胞（位于肝腔內(nèi)的主要巨噬細(xì)胞）用于體外檢查其對(duì)IR-FH4P和IR-FH4P / Triton的分解性能。通過培養(yǎng)KCs并用IR-FH4P孵育一組典型周期（1，3，6，12，24，48，72小時(shí)），對(duì)胰蛋白酶化和收集的KCs進(jìn)行NIR-II亮度測(cè)試（Figure.6b）。定量信號(hào)隨孵育時(shí)間增加，與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)靜脈注射IR-FH4P后的肝臟信號(hào)呈正相關(guān)（Figure.6cd）。為了進(jìn)一步探索分解機(jī)制是否完全依賴于活細(xì)胞，將KCs和4T1細(xì)胞的細(xì)胞裂解物與等效的IR-FH4P一起孵育一段時(shí)間（Figure.6e）。染料孵育細(xì)胞裂解物的NIR-II熒光強(qiáng)度與純裂解物緩沖液（CeLytic M）中的染料相似，表明增強(qiáng)完全是由純裂解物緩沖液中的表面活性劑成分引起的（Figure.6f）。

Figure 6

 

總結(jié)：作者設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)NIR-II S-D-A-D-S染料，并研究了噻吩接頭C3和C4位的烷基鏈取代對(duì)其熒光特性的影響。作者發(fā)現(xiàn)，與常用的C3位取代相比，在噻吩供體的C4位取代的烷基具有更好的量子效率。表面活性劑修飾的S-D-A-D-S染料的NIR-II亮度增強(qiáng)能夠顯著改善成像對(duì)比度，特別是在較短的成像窗口內(nèi)。在短期內(nèi)，表面活性劑修飾的IR-FH4P在體內(nèi)應(yīng)用中與不含表面活性劑的IR-FH4P組相比，提供了3至10倍的熒光增強(qiáng)。對(duì)于淋巴結(jié)定位應(yīng)用，該策略提供了更高的成像對(duì)比度（3倍增強(qiáng)）。使用這種策略，S-D-A-D-S染料被迫與表面活性劑共組裝以防止分子間聚集。此外，與等量的表面活性劑相比，表面活性劑修飾染料系統(tǒng)顯示出很低的細(xì)胞毒性，從而消除了體內(nèi)生物成像的毒性問題。

 

參考文獻(xiàn)

doi.org/10.1039/d2sc05651h

 

 

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