慢性腎臟�。–hronic Kidney Disease, CKD）是全球公共衛(wèi)生問題，并呈進展性、不可逆轉性發(fā)展為終末期腎衰竭（End Stage Renal Dysfunction, ESRD）。ESRD的最終歸途為腎纖維化，其顯著的病理特征表現(xiàn)為腎小球硬化、腎小管萎縮和腎小管間質膠原纖維沉積。足細胞（Podocyte），即腎小囊臟層上皮細胞損傷誘導蛋白尿的產(chǎn)生被認為是腎小球硬化的核心事件。但是足細胞損傷的相關調控機制尚不明確。研究表明，足細胞可作為一種非專職的抗原呈遞細胞介導腎小球腎炎的發(fā)生。體內外實驗研究表明，病理狀態(tài)下足細胞膜表面MHC II類分子表達上調，且共刺激信號分子B7-1的表達水平也出現(xiàn)了顯著增加。

2013年，新英格蘭雜志首次報道B7-1的靶向抑制劑CTLA4-免疫球蛋白融合蛋白（CTLA4-Ig）阿巴西普可以治療原發(fā)和復發(fā)性局灶節(jié)段性腎小球硬化（FSGS）以及微小病變（MCD）患者^[2]。但圍繞著足細胞特異性表達B7-1的檢測及CTLA4-Ig在腎臟病臨床應用爭議不休^[3]。因此，明確足細胞B7-1的特異性表達及作用機制具有十分重要的意義。

2022年6月，南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院腎內科周麗麗教授團隊在Cell Death & Differentiation發(fā)表了題為“B7-1 mediates podocyte injury and glomerulosclerosis through communication with Hsp90ab1-LRP5-β-catenin pathway”的最新研究成果。該研究充分證明了腎小球病理狀態(tài)下，足細胞共刺激信號分子B7-1表達上調，并發(fā)現(xiàn)足細胞B7-1通過Hsp90ab1激活β-catenin信號誘導蛋白尿和腎小損傷的作用機制^[1]。
 

研究材料與方法
在該研究中，研究人員通過RNAscope和免疫熒光共定位等實驗充分證明足細胞損傷誘導B7-1表達上調。為研究足細胞B7-1的致病機制，他們使用了多個小鼠模型，并委托賽業(yè)生物構建了足細胞特異性表達B7-1轉基因小鼠（Tg小鼠）。通過轉錄組測序、IP-MS分析、分子對接模擬、分離腎小球微器官培養(yǎng)、腺相關病毒構建基因敲除小鼠等技術手段，發(fā)現(xiàn)足細胞B7-1與Hsp90ab1相互作用介導β-catenin信號活化，導致足細胞損傷和腎小球硬化的網(wǎng)絡調節(jié)機制。

技術路線
01 腎病患者組織和動物模型中檢測腎小球足細胞B7-1表達水平和足細胞損傷的相關性。
02 構建足細胞特異性過表達B7-1轉基因小鼠，轉錄組測序和實驗分析驗證足細胞B7-1上調表達誘導足細胞損傷及其作用機制。
03 通過體內外阿霉素誘導足細胞損傷模型及B7-1表達干擾實驗，驗證下調B7-1可緩解蛋白尿發(fā)生和足細胞損傷。
04 通過IP-MS實驗及分子對接模擬分析發(fā)現(xiàn)足細胞B7-1與Hsp90ab1的相互作用，并通過LRP5介學β-catenin活化。
05 通過腺相關病毒AAV原位注射干擾Tg小鼠Hsp90ab1表達，并通過抑制劑或質粒注射干擾阿霉素動物模型，明確B7-1通過Hsp90ab1激活β-catenin信號并介導足細胞損傷的效應。
06 細胞實驗及染色質免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)β-catenin活化入核促進足細胞B7-1的表達進一步上調。

研究結果
1.足細胞B7-1在多種腎小球疾病中上調并伴有β-catenin信號激活
既往研究中發(fā)現(xiàn)腎病患者切片腎小球B7-1蛋白檢測存在重復性差的缺點，為此，研究人員通過RNAscope原位雜交技術檢測腎小球B7-1的mRNA水平，并通過足細胞標志物α-actinin4免疫熒光共定位明確B7-1表達上調定位于足細胞。ELISA實驗檢測新入院腎病患者尿液中可溶性B7-1的表達水平，發(fā)現(xiàn)B7-1與腎小球濾過率呈負相關關系，而與尿白蛋白水平呈正相關關系，提示B7-1與足細胞及腎小球損傷密切相關。同時研究人員還對多個腎小球疾病動物模型進行檢測，結果均提示足細胞B7-1表達上調，且腎損傷關鍵調節(jié)蛋白β-catenin信號增強。
 

2.B7-1通過激活β-catenin信號通路介導足細胞損傷
為了探究足細胞B7-1如何介導蛋白尿（Proteinuria）的發(fā)生及足細胞損傷，研究人員委托賽業(yè)公司構建了足細胞特異表達B7-1轉基因小鼠（Tg小鼠）。對自然狀態(tài)下多個時間點的Tg小鼠進行取材及研究發(fā)現(xiàn)，隨著時間推移，足細胞B7-1表達上調，并伴隨尿蛋白水平增加、腎小球結構改變及足細胞上皮標志物的丟失。通過轉錄組測序及相關驗證發(fā)現(xiàn)Tg小鼠腎臟組織β-catenin信號活化。相反，將B7-1基因表達敲低可以抑制β-連環(huán)蛋白從而減輕足細胞損傷和腎小球損傷。
 

3.Hsp90ab1在B7-1向LRP5/β-catenin通路的信號傳遞中起關鍵作用
為了進一步探究足細胞B7-1如何通過β-catenin信號通路介導足細胞損傷，研究人員采用足細胞過表達B7-1并進行IP-MS技術鑒定分析，并通過體內外蛋白質免疫共沉淀及免疫熒光共定位等手段進行驗證，發(fā)現(xiàn)B7-1可能通過Hsp90ab1介導β-catenin信號通路。
 

 

B7-1與Hsp90ab1究竟是如何相互作用，并介導β-catenin活化的呢，研究人員通過分子對接模擬和蛋白定點突變等方法進行驗證，發(fā)現(xiàn)位于Hsp90ab1N端的K69位點可能是B7-1的有效結合位點，介導了B7-1的下游效應。同時，通過文獻查閱發(fā)現(xiàn)，Hsp90ab1可能通過結合LRP5激活β-catenin,為此研究人員進一步模擬出了三者的結合構象，并對其進行了相關驗證，結果顯示B7-1-Hsp90ab1-LRP5復合體形成可能是介導β-catenin信號通路的重要橋梁。

圖4 分子對接模擬確定B7-1與Hsp90ab1的結合位點，B7-1通過Hsp90ab1及LRP5傳遞信號激活β-catenin信號^[1]

 

4.Hsp90ab1介導B7-1誘導的足細胞損傷和腎小球損傷

為了進一步明確Hsp90ab1的作用，研究人員通過AAV原位注射實驗干擾Tg小鼠腎臟Hsp90ab1表達水平。結果發(fā)現(xiàn)，敲低Hsp90ab1表達可以抑制β-catenin活化，減輕由B7-1誘導的蛋白尿和足細胞損傷。
 

圖5 敲低Hsp90ab1可通過抑制β-catenin信號減輕足細胞B7-1上調誘導的足細胞損傷^[1]

 

β-catenin信號活化是否對B7-1也有作用呢，研究人員通過染色質免疫共沉淀的方法進行驗證，發(fā)現(xiàn)，活化的β-catenin轉位入核介導B7-1的轉錄調控，從而構成正反饋調節(jié)環(huán)。

研究結論

圖7 足細胞B7-1介導β-catenin信號活化誘導足細胞損傷的潛在機制^[1]

 

綜上所述，該研究綜合了RNAscope、Tg小鼠、轉錄組測序、蛋白質譜測序、分子對接模擬及AAV原位注射等技術手段，充分說明了腎小球損傷誘導足細胞B7-1表達上調，繼而通過B7-1與Hsp90ab1的相互作用介導B7-1-Hsp90ab1-LRP5復合體的形成，促進β-catenin活化發(fā)生酪氨酸磷酸化進一步轉位入核繼而引起下游級聯(lián)反應。此外，β-catenin入核可以繼續(xù)調控B7-1的基因轉錄水平，B7-1與β-catenin通路形成正反饋調節(jié)環(huán)路從而促進足細胞損傷和腎小球硬化的持續(xù)進展。

參考文獻：

[1] Li, J., et al., B7-1 mediates podocyte injury and glomerulosclerosis through communication with Hsp90ab1-LRP5-beta-catenin pathway. Cell Death Differ, 2022.

[2] Yu, C.C., et al., Abatacept in B7-1-positive proteinuric kidney disease. N Engl J Med, 2013. 369(25): p. 2416-23.

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品系編號：
KOCMP-12519-Cd80-B6J-VA

產(chǎn)品編號：
S-KO-01432

應用方向：
免疫系統(tǒng),細胞增殖細胞組成,造血系統(tǒng),細胞生物學,代謝研究,生理系統(tǒng),分子生物學

打靶方案：

B71 Flox小鼠
（Cd80 Flox小鼠）

品系名稱：
C57BL/6J-Cd80^em1(flox)Cya

品系編號：
CKOCMP-12519-Cd80-B6J-VB

產(chǎn)品編號：
S-CKO-17617

應用方向：
免疫系統(tǒng),細胞增殖細胞組成,造血系統(tǒng),細胞生物學,代謝研究,生理系統(tǒng),分子生物學

打靶方案：

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