海洋生物細(xì)胞由于其復(fù)雜性，在單細(xì)胞測(cè)序?qū)嶒?yàn)中成功率往往較低。而BD Rhapsody憑借其特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，讓海洋生物單細(xì)胞測(cè)序研究不再有后顧之憂：

1.BD Rhapsody最大程度降低外界對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾

基于微孔板原理，細(xì)胞自然沉降，不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生任何壓力刺激，在細(xì)胞裂解后，磁珠捕獲mRNA，之后被磁鐵回收，所有外界干擾因素如化學(xué)試劑、金屬離子、酶等都會(huì)被清洗，在干凈的反應(yīng)體系中進(jìn)行后續(xù)反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，最大程度降低細(xì)胞剪切力、溫度、化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞的刺激和影響，不會(huì)改變轉(zhuǎn)錄本表達(dá)特征，真實(shí)還原實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)預(yù)期條件。

2. BD Rhapsody  Scanner質(zhì)控系統(tǒng)，過程監(jiān)控，確保質(zhì)量

尤其是有些海洋生物細(xì)胞偏小、mRNA含量偏低，在細(xì)胞捕獲過程中，會(huì)造成一定的細(xì)胞數(shù)目偏差。BD Scanner可視化質(zhì)控系統(tǒng)，能實(shí)時(shí)監(jiān)控單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)情況并輸出包含細(xì)胞濃度、細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞活性、雙細(xì)胞率、細(xì)胞回收率、磁珠回收率等數(shù)據(jù)報(bào)告，從而可以及時(shí)調(diào)整實(shí)驗(yàn)參數(shù)，有效保證實(shí)驗(yàn)質(zhì)量。

那么如何利用BD Rhapsody進(jìn)行海洋生物單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)�？下面就�?ldquo;小海膽”一起看一篇文獻(xiàn)實(shí)例吧~

研究背景

合子基因組激活是胚胎早期發(fā)育過程中一個(gè)普遍的過程，涉及到合子細(xì)胞核的重編程，并啟動(dòng)整體轉(zhuǎn)錄。近些年來，研究者使用不同的生物模型來探究這個(gè)過程，并且提出了不同的合子基因組激活機(jī)制的模型，包括核質(zhì)比模型，激活因子積累模型，染色質(zhì)動(dòng)態(tài)變化模型。然而合子基因組激活卻仍未有一個(gè)共性的認(rèn)知，尤其是對(duì)管家基因再激活過程。海鞘作為脊椎動(dòng)物的近親之一，已被用于胚胎研究多年，多種不同海鞘的細(xì)胞譜系已得到表征，并且也有基因組測(cè)序數(shù)據(jù)。

2022年6月1日，中國(guó)海洋大學(xué)董波研究團(tuán)隊(duì)和昆明理工大學(xué)陳凱團(tuán)隊(duì)，在bioRxiv上發(fā)表了題為“Spatiotemporal dynamics of zygotic genome activation in basal chordates revealed by interspecific hybrids”的研究論文。該研究論文利用兩種不同的海鞘物種進(jìn)行雜交，通過同源基因的多樣性區(qū)分不同來源的基因，發(fā)現(xiàn)了在8細(xì)胞到110細(xì)胞階段會(huì)有兩波分別代表早期胚胎發(fā)育和管家基因再激活的合子基因組激活過程。比較分析揭示了母本與合子基因間的調(diào)控以及等位特異性表達(dá)的調(diào)控是以物種的方式而不是親本相關(guān)的方式。作者利用BD Rhapsody單細(xì)胞平臺(tái)解析了早期神經(jīng)元階段海鞘胚胎單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組譜式，揭示了父源管家基因的時(shí)空差異性激活與每種細(xì)胞類型的力學(xué)性質(zhì)顯著相關(guān)。這為人們了解基底脊索動(dòng)物的進(jìn)化和適應(yīng)提供了新的研究系統(tǒng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

兩種不同海鞘物種的雜交及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

Ciona robusta 和 C. savignyi 是兩種形態(tài)相似但已經(jīng)分開進(jìn)化122百萬(wàn)年的被囊動(dòng)物。這兩種海鞘高度分化且具有互育性，因此可以作為研究雜交胚胎的優(yōu)秀模型。作者首先評(píng)估了雜交胚胎的發(fā)育能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在尾芽期胚胎之前，不同雜交的胚胎發(fā)育時(shí)相和形態(tài)是類似的。盡管這兩種海鞘形態(tài)相似，但在基因組上有很大差異，因此可以用于區(qū)分等位基因的親本來源。為了解析合子轉(zhuǎn)錄本的激活，作者收集了1,2,4,8,16,32,64,100細(xì)胞時(shí)期胚胎和中期囊胚，早期神經(jīng)元進(jìn)行bulk RNA測(cè)序，64細(xì)胞，110細(xì)胞和早期神經(jīng)元階段進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序。

胚胎早期發(fā)育過程中兩波協(xié)調(diào)的合子激活

作者將 C. robusta 和 C. savignyi 的雜交胚胎的RNA數(shù)據(jù)比對(duì)回基因組發(fā)現(xiàn)，不管是Cs ♂ × Cr♀ 或 Cr ♂ × Cs♀的胚胎，在4細(xì)胞之前，>99.99%的數(shù)據(jù)都比對(duì)到了母本。父本轉(zhuǎn)錄組從8細(xì)胞時(shí)期開始檢測(cè)到，從16到32細(xì)胞階段比例開始顯著增加。另一個(gè)階段是從64細(xì)胞到110細(xì)胞階段，父本轉(zhuǎn)錄組比例開始增加。這種父母本基因組不同比例轉(zhuǎn)錄本的情況在神經(jīng)元早期和晚期開始消失。

作者接下來分析了基因表達(dá)水平的FPKM值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)合子基因的首次表達(dá)出現(xiàn)在8細(xì)胞階段，在從16到32細(xì)胞階段以及從64到110細(xì)胞階段開始增加。父源基因的WGCNA分析發(fā)現(xiàn)，Cs♂ × Cr♀子代胚胎的基因可以分為5類，1類基因在16到32細(xì)胞階段上調(diào)，2到3類基因在64到100細(xì)胞階段上調(diào)。GO分析發(fā)現(xiàn)1類基因主要與調(diào)控相關(guān)，可能在第2波合子激活過程中起到調(diào)節(jié)作用。

Figure1. 海鞘胚胎發(fā)育過程中兩波協(xié)調(diào)的合子激活

雜交模型胚胎發(fā)育過程中等位基因的激活

接下來作者比較了母本中兩波合子激活的調(diào)控關(guān)系。兩個(gè)物種中整體調(diào)控的模式可能是相似的。作者首先鑒定了調(diào)控基序注釋好的轉(zhuǎn)錄因子，接下來就開始查看這些轉(zhuǎn)錄因子與對(duì)應(yīng)基因之間的調(diào)控關(guān)系�；�序分析發(fā)現(xiàn)第一波合子激活中調(diào)控基因多與母本轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)，而第二波合子激活中則與合子表達(dá)基因相關(guān)。通過比較兩種物種的發(fā)育相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)，合子激活中兩個(gè)物種間轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控基因的關(guān)系是相似的。

作者進(jìn)一步分析了等位基因特異性表達(dá)的情況，在檢測(cè)到的5,879個(gè)同源基因中，有341個(gè)基因是合子特異性表達(dá)的。從8細(xì)胞到32細(xì)胞階段的早期表達(dá)基因主要都是母本主導(dǎo)基因，而在64到110細(xì)胞胚胎的過渡階段，開始檢測(cè)到更多的父源基因。從110細(xì)胞胚胎到晚期神經(jīng)元階段，分別有138和106個(gè)基因是Cr和Cs主導(dǎo)的。

Figure2. 雜交模型胚胎發(fā)育過程中等位基因的激活

單細(xì)胞測(cè)序揭示管家基因的激活

Ciona的不對(duì)稱分裂從16細(xì)胞階段起始，時(shí)間點(diǎn)要比管家基因的再激活要早。同時(shí)Ciona胚胎的不變譜系的嵌合發(fā)育為研究合子激活提供了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。作者利用BD Rhapsody單細(xì)胞平臺(tái)檢測(cè)了早期神經(jīng)元胚胎階段的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)64細(xì)胞，110細(xì)胞和早期神經(jīng)元階段細(xì)胞分別可以被分成9,12,19個(gè)細(xì)胞群，而這些細(xì)胞群可以進(jìn)一步被注釋成內(nèi)胚層、脊索、間充質(zhì)、肌肉、神經(jīng)索、神經(jīng)和表皮等。作者比較了每個(gè)細(xì)胞群的合子激活。在64細(xì)胞階段，內(nèi)胚層細(xì)胞中有最高比例的父本轉(zhuǎn)錄組激活。在神經(jīng)元早期，神經(jīng)索和間充質(zhì)B細(xì)胞的父系轉(zhuǎn)錄本增加，各類細(xì)胞群的父系轉(zhuǎn)錄本比例的差異開始縮小。不同譜系中父系管家基因的重新激活存在差異，這表明管家基因的重新激活并不遵循發(fā)育時(shí)鐘模型。此外，作者還用這些數(shù)據(jù)檢測(cè)了其他合子激活模型的可靠性。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂時(shí)間與合子基因激活時(shí)間不相關(guān)，細(xì)胞體積也與Ciona合子激活不相關(guān)。

Figure3. 單細(xì)胞測(cè)序揭示管家基因的激活

總結(jié)與展望

這項(xiàng)研究工作利用兩種高度分化的海鞘進(jìn)行雜交，通過同源基因的多樣性來區(qū)分不同基因來源。通過對(duì)不同時(shí)期雜交胚胎的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，雜交胚胎的合子激活主要有兩個(gè)階段，第一波主要從16到32細(xì)胞階，而第二波則從64細(xì)胞到110細(xì)胞階段，父本轉(zhuǎn)錄組比例開始增加，并且兩波合子基因組激活是有協(xié)調(diào)作用的。最終，論文通過雜交胚胎解析了合子基因組激活的過程和調(diào)控機(jī)制，并且為研究人員了解基底脊索動(dòng)物的進(jìn)化和適應(yīng)提供了新的研究系統(tǒng)。在這項(xiàng)研究中，BD Rhapsody單細(xì)胞平臺(tái)發(fā)揮了重要作用，揭示了早期神經(jīng)元胚胎階段的單細(xì)胞圖譜和早期神經(jīng)元階段細(xì)胞的等位特異性表達(dá)，為解析胚胎合子激活的過程提供了數(shù)據(jù)。

單細(xì)胞多組學(xué)平臺(tái)
BD Rhapsody™
BD Rhapsody™ 單細(xì)胞多組學(xué)分析系統(tǒng)能夠?qū)Τ汕�上萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞的蛋白與基因進(jìn)行數(shù)字定量，提供靈活的定制化Panel及標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用方案，以滿足不同的實(shí)驗(yàn)需求，其獨(dú)特的混樣技術(shù)可有效節(jié)約時(shí)間與成本。